Введение
1. Структурно-функциональная организация кластора рибосомных генов эукариот 12
1.1 РНК-полимераза I 12
1.2 Организация рибосомных генов в геноме эукариот 14
1.3 Промотор Рої I и структура нетранскрибируемого спейсера 17
1.4 Регуляция количества копий рибосомной ДНК 21
1.5 Инсерции в генах рибосомных РНК 28
2. Эволюционная изменчивость кластера рибосомных генов эукариот 34
2.1 Согласованная (концертная) эволюция повторяющихся структурных единиц кластера рибосомных генов эукариот 34
2.2 Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК 37
2.3 Эволюционная изменчивость транскрибируемых внешних и внутренних слейсеров 42
2.4 Эволюционная изменчивость нетранскрибируемых спейсеров 44
3. Общая характеристика денсовирусов. Денсовирусы как векторы для генетической трансформации насекомых и анализа регуляторных элементов генома 46
Материалы и методы 51
Условия содержания В. дегтапіса в инсектарии 51
Поддержание культуры и наращивание биомассы Tetrahymena pyriformis 51
Выделение и очистка тотальной ДНК 52
A) Инфузорий 52
Б) Тараканов 54
B) Растений 54
Г) Других эукариот, исследованных в данной работе 55
Гель-электрофорез и элюция фрагментов ДНК 56
Выделение нативных амплифицированных копий ДНК Tetrahymena pyriformis 56
Получение и очистка FF-фрагмента 57
Ферментативная обработка ДНК 58
Трансформация В. со// 58
Выделение плазмидной ДНК из В. соН 59
Очистка плазмидной ДНК 59
Введение метки в ДНК 60
Саузерн-блот анализ 61
Полимеразная цепная реакция 62
Методы работы с РНК 63
Методы работы с вирусом 64
Электронная микроскопия 64
Клонирование вирусной ДНК 64
Секвенирование ДНК 65
Методы статистической обработки 66
Эксперименты на вьюнах (Misgurnus fossilis) 67
Стимуляция созревания ооцитов и получение оплодотворенной икры 67
Микроинъекции ДНК в зиготы вьюна 68
Определение активности р-галактозидазы 69
Результаты и обсуждение 70
1 . Анализ in siuco генов рибосомных рнк эукариот 70
1.1 28S-подобные гены рибосомных РНК 71
1.2 18S- подобные гены рибосомных РНК 74
2 . Создание универсальных праимеров и зондов, позволяющих методами пцр и блот гибридизации анализировать структуру рибосомной днк эукариот 81
2.1 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК Tetrahymena pyriformis . 81
2.2 Демонстрация применимости полученных универсальных праимеров и зондов для анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов животных и растений. 85
2.3 Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов: Drosophila melanogaster и Drosophila simulans 87
2.4 Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного (Pisum sativum^ 91
2.5 ПДРФ рДНК на секомых отряда тараканы 91
3. Клонирование, секвенирование и описание структуры полноразмерного повтора рднк рыжего таракана bla ttella germanica 1 00
4. Внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спеисера рднк blattella germanica 110
4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК 110
4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК 117
4.3 Анализ генетической структуры лабораторных линий рыжего таракана 122
4.4 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана 129
5. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной днк отряда blattodea 142
5.1 Построение филогенетического древа отряда Blattodea на основе нуклеотидных последовательностей генов 28S рРНК 152
5.2 Анализ эволюционной изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов BlatteHa и Periplaneta 164
- Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых спейсеров 164
- Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров 180
5.3 Анализ эволюционной изменчивости 5.8S генов у представителей отряда Тараканы 185
6. Дєнсовирус рыжего таракана blattella germanicai обнаружение последовательность нуклеотидов и организация генома 187
6.1 Обнаружение и электронно-микроскопическое исследование вируса 189
6.2 Клонирование вирусной ДНК 193
6.3 Последовательность нуклеотидов генома вируса и структура концевых инвертированных повторов 195
6.4 Структура генома 204
- Характеристика открытых рамок считывания и сравнительный анализ белковых последовательностей. 204
- Промоторы 205
- Сигналы полиаденилирования 205
Выводы 211
Приложение 213
Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под
Контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (mlsgurnus fossilis l.) 214
Список литературы 223
