Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Биопленка холерного вибриона 16
1.1.1. Роль биопленки в выживании V. cholerae во внешней среде 16
1.1.2. Механизмы регуляции образования биопленки 22
1.2 Механизмы адаптации возбудителя холеры к условиям различной осмолярности 27
1.3 Адаптация V. cholerae к оксидативному стрессу 34
1.4. Адаптация V. cholerae к температурному стрессу 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Бактериальные штаммы 41
2.2. Питательные среды и реактивы 43
2.3. Методы
2.3.1. Культивирование бактериальных штаммов 44
2.3.2. Определение продукции холерного токсина 44
2.3.3. Определение продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии 45
2.3.4. Определение биосинтеза растворимой гемагглютинин/протеазы, фосфолипазы, гемолизина, а также подвижности 45
2.3.5. Способность штаммов V. cholerae формировать биопленку 46
2.3.6. Исследование выживаемости штаммов при недостатке питательных веществ и изменении температуры 46
2.3.7. Определение устойчивости штаммов к осмотическому и оксидативному стрессам 46
2.3.8. Белковый электрофорез и выявление экзополисахарида 47
2.3.9. Атомно-силовая микроскопия 48
2.3.10. ПЦР-анализ 48
2.3.11.Секвенирование 51
2.3.12. Статистическая обработка 51
ГЛАВА 3. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов, необходимых для формирования биопленки, в штаммах геновариантов v. cholerae биовара ЭЛЬ ТОР 52
3.1. Сравнительный (in silico) анализ нуклеотидной последовательности генов, участвующих в процессе формирования биопленки, в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в разные годы на территорию Российской Федерации 52
3.2. Сравнительный анализ способности штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к формированию биопленки 55
ГЛАВА 4. Влияния стрессовых факторов на штаммы геновариантов v. cholerae биовара Эль Тор 60
4.1 Изучение экспрессии генов и анализ структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор при нахождении в условиях недостатка питательных веществ 60
4.2. Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор 69
4.2.1 Сравнительная устойчивость штаммов V. cholerae биовара Эль Тор к действию высокой и низкой температур 69
4.2.2 Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор 71
4.3 Анализ экспрессии генов и структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор после действияосмотического и оксидативного стрессов 76
4.3.1 Сравнительная устойчивость штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к действию осмотического и оксидативного стрессов 76
4.3.2 Исследование экспрессии генов в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, подвергшихся действию осмотического и оксидативного стрессов 79
4.3.3 Анализ стабильности структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, подвергшихся действию осмотического и оксидативного стрессов 81
ГЛАВА 5. Разработка мультиплексной пцр для одновременной идентификации штаммов геновариантов v. cholerae о1 серогруппы биовара эль тор и определения их эпидемического потенциала 84
5.1. Создание мультиплексной ПЦР для идентификации геновариантов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и определении их эпидемического потенциала 84
5.2. Изучение эффективности и специфичности разработанного метода ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
Выводы 106
Список используемых источников 108
