Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Общие представления о биспецифических антителах 15
2.1.1. История создания биспецифических антител и области их применения 15
2.1.2. Способы получения биспецифических моноклональных антител 18
2.1.3. Тестирование биспецифических моноклональных антител 21
2.1.4. Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах 22
2.1.5. Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител 26
2.1.6. Применение биспецифических моноклональных антител в твердофазных методах 3 О
2.2. Принцип работы и устройство биосенсора lAsys 34
3. Приложение 40
3.1. Теоретические основы анализа связывания антител с антигеном 40
3.1.1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе 41
3.1.2. Анализ равновесного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 43
3.1.3. Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 44
3.1.4. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass) в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 47
3.1.5. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания антител с иммобилизованным антигеном 48
3.1.6. Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител 49
3.1.7. Кинетический анализ связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 49
3.1.8. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемых кинетических констант в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 51
3.2. Заключение 51
4. Экспериментальная часть 53
4.1. Реагенты и оборудование 53
4.2. Методы исследований 54
4.2.1. Клеточные линии 54
4.2.2. Приготовление аффинных носителей 55
4.2.3. Аффинная очистка моноспецифических антител 56
4.2.4. Аффинная очистка биспецифических антител 56
4.2.5. Определение концентрации белка 58
4.2.6. Определение антипероксидазной активности антител 58
4.2.7. Определение антигенсвязывающей активности антител 59
4.2.8. Определение активности биспецифических антител иммуноферментным методом с двумя антигенами 60
4.2.9. Анализ связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуно ферментным методом 61
4.2.10. Приготовление антител, меченых п\ и их очистка 61
4.2.11. Определение концентрации меченых I антител после аффинной очистки 62
4.2.12. Анализ связывания I-меченых антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе 62
4.2.13. Анализ связывания и определение наблюдаемой равновесной константы ассоциации антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом 63
4.2.14. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия 64 4.3. Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью биосенсора IAsys 66
4.3.1. Иммобилизация антигенов (HRP и hlgGl) на поверхность CDM кюветы биосенсора IAsys 67
4.3.2. Тестирование условий распада иммунологического комплекса 71
4.3.3. Кинетика взаимодействия антител с иммобилизованными HRP и hlgGl 71
4.3.4. Обработка, преобразование и анализ кинетических кривых, получаемых с помощью биосенсора IAsys 74
5. Результаты и их обсуждение 78
5.1. Изучение связывания родительских и бнспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом 79
5.2. Изучение связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом 90
5.3. Анализ параметров связывания антител с иммобилизованными антигенами с помощью оптического биосенсора lAsys 100
Выводы 114
Список литературы 117
Благодарности 131
