Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Возможности генной инженерии 11
1.2. Методы получения трансгенных растений 15
1.3. Встраивание Т-ДНК в геном растения при агробактериальной трансформации .21
1.4. Цитокины и их применение в медицине и ветеринарии 26
1.5. Цитокины I класса (гемопоэтины), синтезированные в растениях .32
1.6. Цитокины II класса, синтезированные в растениях 39
1.7. Методы повышения производительности экспрессии чужеродных соединений в растениях .48
1.8. Заключение 54
Глава 2. Материалы и методы исследования .57
2.1. Растительный материал .57
2.2. Штаммы микроорганизмов 60
2.3. Трансформация моркови Agrobacterum (Rhizobium) rhizogenes .63
2.4. GUS-окрашивание .64
2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами 64
2.5.1. Выделение ДНК .64
2.5.2. Выделение РНК .65
2.5.3. Обратная транскрипция 66
2.5.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, ПЦР-РВ) 66
2.5.5. «Прогулка по геному», FPNI-PCR .67
2.5.6. Gateway 69
2.5.7. Плазмиды 69
2.5.8. Праймеры 69
2.6. Методы работы с белками 73
2.6.1. Выделение цитоплазматических растительных белков 73
2.6.2. Вестерн-блот анализ 75
2.7. Оценка биологической активности рекомбинантного белка на культуре клеток быка 78
2.8. Испытание рекомбинантного белка на лабораторных животных .82
2.9. Статистические методы и компьютерные программы. используемые в работе 86
Глава 3. Результаты .88
3.1. Исследование трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum) поколения Т4-Т5 88
3.1.1. Анализ наследования гетерологичного гена sIFNG 88
3.1.2. Анализ экспрессии гена гамма-интерферона у трансгенных растений табака поколения Т5 89
3.2. Белок гамма-интерферон из трансгенных растений .90
3.2.1. Анализ трансгенных растений табака на наличие гетерологичного белка гамма-интерферона 90
3.2.2. Измерение активности рекомбинантного белка на культуре клеток быка .90
3.2.3. Изучение активности рекомбинантного белка при пероральном применении .93
3.3. Причины различия в продуктивности между линиями растений табака Inter311 и InterB6
3.3.1. Последовательность Т-ДНК вставки у растений .99
3.3.2. Поиск сайтов встраивания Т-ДНК 102
3.4. Создание генетических конструкций для высокоэффективной тканеспецифичной экспрессии 107
3.4.1. Клонирование промотора pZmRCP-1 кукурузы .108
3.4.2. Клонирование промотора pIbSRD1 батата .108
3.4.3. Создание векторов для визуализации экспрессии методом Gateway .108
3.4.4. Создание векторов для синтеза бычьего гамма-интерферона 109
3.5. Создание трансгенных растений моркови в результате трансформации А. rhizogenes 111
3.5.1. Визуализация зон экспрессии промоторов pZmRCP-1 и plbSRD 1 111
3.5.2. Создание “бородатых корней” моркови, продуцирующих бычий гамма интерферон 112
Глава 4. Обсуждение 116
4.1. Растения табака стабильно наследуют и экспрессируют бычий гамма-интерферон на протяжении пяти поколений 116
4.2. Рекомбинантный бычий гамма-интерферон растительного происхождения проявляет биологическую активность 117
4.3. Разница в продуктивности между линиями табака обусловлена разными сайтами встраивания и многокопийной встройкой 119
4.4. Промотор plbSRDl может быть использован для получения растений-продуцентов 121
4.5. Существуют две формы промотора plbSRDl, различающиеся по активности 122
Заключение 123
Выводы 124
Список сокращений 126
Список литературы 127
Благодарности 154
