Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Афобазол – мультитаргетный анксиолитик нового поколения 13
1.2 Sigma1R
1.2.1 Структура Sigma1R 14
1.2.2 Экспрессия Sigma1R в ЦНС и периферических тканях 18
1.2.3 Локализация Sigma1R в клетке 19
1.2.4 Функции Sigma1R
1.2.4.1 Активация шаперона Bip 20
1.2.4.2 Транслокация Sigma1R в область цитоплазматической и ядерной 22 мембран
1.2.4.3 Регуляция Sigmar1 сигнального пути IRE1- XBP1 23
1.2.4.4 Регуляция сигнального пути Sigma1R- Insig1 24
1.2.4.5 Регуляция сигнального пути Sigma1R- Nrf2 25
1.2.4.6 Регуляция фосфолипазного пути трансдукции 25
1.2.4.7 Модуляция активности ионных каналов и рецепторов 27 цитоплазматической мембраны
1.2.5 Лиганды Sigma1R 30
2 Материалы и методы исследования 35
2.1 Препараты 35
2.2 Экспериментальные животные 36
2.2.1 Прижизненные манипуляции с животными 36
2.3 Метод радиолигандного анализа
2.3.1 Получение мембранных фракций 37
2.3.2 Конкурентное взаимодействие исследуемых соединений с [3H](+)-пентазоцином и [G-3H]PRE-084 в мембранных фракциях головного мозга мышей 38
2.3.3 Сцинтилляционный счет радиоактивности 42
2.3.4 Построение кривых конкурентного вытеснения меченых лигандов исследуемыми соединениями 42
2.3.5 Расчет значений параметра IC50 и IC50Hi 42
2.3.6 Расчет значений специфического связывания [3H](+)-пентазоцина 44
2.3.7 Определение содержания белка 44
2.3.8 Статистическая обработка данных 44
2.4 Метод иммунофлюоресцентного окрашивания 45
2.4.1 Культура клеток 45
2.4.2 Пробоподготовка для микроскопии
2.4.2.1 Визуализация липидных рафтов 45
2.4.2.2 Одновременная визуализация липидных рафтов и Sigma1R 2.4.3 Конфокальная микроскопия 46
2.4.4 Обработка данных 47
3 Результаты иследования
3.1 Сравнительный анализ аффинности афобазола к Sigmar1 в Р2 фракции головного мозга интактных мышей CD-1 при конкурентном взаимодействии с [3H](+)-пентазоцином 48
3.2 Анализ конкурентного взаимодействия афобазола с прототипными лигандами Sigmar1 [3H](+)-пентазоцином и [G-3H]PRE-084 в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 in vitro 51
3.3 Анализ различий в связывании [3H](+)-пентазоцина с Sigmar1 в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 55
3.4 Влияние афобазола на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 ex vivo 57
3.5 Влияние эмоционально-стрессовых воздействий на специфическое
связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD 1, BALB/c и C57BL/6 60
3.5.1 Влияние процедуры внутрибрюшинной инъекции на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 61
3.5.2 Влияние эмоционально-стрессового воздействия в тесте «Открытое поле» на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 63
3.5.3 Комплексное воздействие процедуры внутрибрюшинной инъекции и тестирования в «Открытом поле» на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 67
3.6 Влияние афобазола ex vivo в условиях эмоционально-стрессовых воздействий на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 73
3.6.1 Влияние афобазола ex vivo на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 в условиях стрессового воздействия процедуры внутрибрюшинной инъекции 73
3.6.2 Влияние афобазола ex vivo на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 в условиях стрессового воздействия процедуры внутрибрюшинной инъекции и тестирования в «Открытом поле» 79
3.7 Определение влияния афобазола in vitro на внутриклеточную локализацию липидных рафтов и Sigmar1 в живых астроцитах человека 83
4 Обсуждение результатов 91
4.1 Эндогенные лиганды Sigmarl 91
4.2 Специфическое связывание [3Н](+)-пентазоцина с Sigmar1 при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола 93
4.3 Влияние афобазола in vitro на внутриклеточную локализацию липидных рафтов и Sigmar1 в живых астроцитах человека 98
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список сокращений 105
Список литературы 107
Благодарности
