Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных гранулоцитов 14
2.2. Характеристика белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов 20
2.2.1. Лактоферрин 21
2.2.2. Антимикробные пептиды. Структура. Классификация. Механизмы действия 26
2.2.2.1. Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов крыс 33
2.3. Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета 34
2.4. Физиология стресса 37
2.5. Стресс и иммунная система 40
2.5.1. Стресс и система крови 43
3. Методы исследования 46
3.1. Экспериментальные животные и модель исследования 46
3.2. Получение биологического материала 47 3.2.1. Получение экссудата 47
3.3. Выделение дефенсинов из нейтрофилов экссудата крыс 47
3.3.1. Экстракция катионных пептидов из лейкоцитарных клеток . 47
3.3.2. Ультрафильтрация 48
3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография 48
3.3.4. Удаление примеси липополисахарида 49
3.4. Электрофоретические методы 49
3.4.1 Электрофорез в кислой буферной системе 49
3.5. Иммунохимические методы исследования 50
3.5.1. Получение антисывороток к дефенсинам 50
3.5.1.1. Конъюгация дефенсинов крысы с овальбумином 50
3.5.1.2. Иммунизация кроликов конъюгатом дефенсинов с овальбумином 51
3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток 52
3.5.2.1. Связывание дефенсинов крысы с цианоген бромид-активированной агарозной матрицей 52
3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания 53
3.5.2.3. Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хромотографии 53
3.5.3. Конъюгация антител с пероксидазой хрена 54
3.5.4. Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие специфических антител 54
3.5.5. Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации RatNP-3 в плазме крови экспериментальных крыс 55
3.5.6. Иммуноферментный анализ по определению концентрации кортикостерона 56
3.6. Цитологические методы исследования 58
3.6.1. Подсчет лейкоцитарной формулы крови 58
3.6.2. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева 58
3.7. Определение примеси ЛПС в пробах 59
3.8. Метод полимеразой цепной реакции 60
3.8.1. Выделение матричной РНК из спленоцитов крыс . 60
3.8.2. Получение кДНК из мРНК . 62
3.8.3. Проведение полимеразной цепной реакции . 62
3.9. Статистическая обработка результатов 64
4. Результаты и обсуждение . 65
4.1. Выделение дефенсинов крыс из нейтрофильных гранулоцитов . 65
4.1.1. Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы и их фракционирование методом ультрафильтрации 65
4.1.2. Очистка и разделение дефенсинов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 67
4.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения концентрации RatNP-3 в биологических жидкостях крыс 70
4.3. Иммуномодулирующие свойства антимикробных белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов 75
4.3.1. Динамика изменений концентрации кортикостерона, распределения лейкоцитов в крови и дегрануляции нейтрофильных гранулоцитов у крыс при экспериментальном стрессе 75
4.3.2. Динамика изменений экспрессии генов цитокинов и TLR4 в селезенке крыс при экспериментальном стрессе 82
4.3.3. Влияние введения лактоферрина человека и дефенсина крысы RatNP-3 на лейкоцитарный состав крови, продукцию кортикостерона, экспрессию генов цитокинов и TLR4 крысы в отсутствии стрессирующего воздействия 88
4.3.4. Влияние введения лактоферрина человека на развитие стресс-реакции в условиях экспериментального стресса 94
4.3.5. Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стресс-индуцированные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и TLR4 103
4.3.6. Влияние введения дефенсина крыс RatNP-3 на течение экспериментального стресса 110
4.3.7. Влияние введения антител к суммарной фракции дефенсинов крыс на течение экспериментального стресса 116
5. Заключение 119
6. Выводы 121
Список сокращений 123
Список литературы 124
