Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Инфекционные заболевания, вызываемые грамположительными бактериями 15
1.1.1 Золотистый стафилококк S. aureus 16
1.1.2 Характеристика ротовой микрофлоры 17
1.1.3 Особенности бактерий Bacillus cereus 19
1.2 Антибиотикотерапия инфекций, вызываемых грамположительными бактериями 22
1.3 Влияние антибиотиков на вирулентность S. aureus 23
1.3.1 Подавление белкового синтеза в клетках 24
1.3.2 Нарушение синтеза клеточной стенки 25
1.3.3 SOS-ответ 25
1.3.4 Глобальные регуляторы вирулентности 26
1.4 Бактериальные биопленки и их структура 28
1.4.1 Образование биопленок бактериями вида S. aureus 33
1.4.2 Формирование биопленок как фактор вирулентности 34
1.5 Устойчивость биопленок к антибиотикотерапии 35
1.6 Производные фуранонов как антибактериальные соединения 36
Заключение 38
Экспериментальная часть 39
2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Исследуемые соединения 39
2.2 Методы работы с бактериальными клетками 40
2.2.1 Штаммы 40
2.2.2 Питательные среды 40
2.2.3 Культивирование бактерий 41
2.2.4 Определение количества КОЕ 41
2.2.5 Определение минимальной подавляющей (МПК) и минимальной бактерицидной концентраций (МБК) 42
2.2.6 Окрашивание биопленки генциановым фиолетовым 42
2.2.7 Оценка антимикробных агентов на способность к эрадикации сформированных бактериальных биопленок 43
2.2.8 Анализ кривой эрадикации от времени (Time-kill assay) 43
2.2.9 Анализ антимикробного эффекта при комбинированном применении антимикробных агентов (метод шахматной доски, den Hollander, 1998) 44
2.2.10 Оценка развития устойчивости 45
2.2.10.1 Получение устойчивых штаммов на чашках с градиентным агаром 45
2.2.10.2 Получение устойчивых штаммов на жидкой питательной среде в планшетах 45
2.3 Работа с эукариотическими клетками 46
2.3.1 Линии клеток 46
2.3.2 Условия культивирования 46
2.3.3 Оценка митохондриальной активности 46
2.3.4 Оценка повреждения плазматической мембраны 47
2.4 Микроскопия 47
2.4.1 Световая микроскопия 47
2.4.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) 47
2.4.3 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 48
2.5 Методы работы с белками 48
2.5.1 Электрофорез белков в нативных условиях 48
2.5.2 Окрашивание полиакриламидных гелей нитратом серебра 49
2.5.3 Идентификация белков-субстратов для соединения Ф105 49
2.6 Аналитические методы 50
2.6.1 Оценка внутриклеточного уровня активных форм кислорода 50
2.6.2 Оценка мембранного потенциала 50
2.6.3 Определение активности глутаминсинтетазы 50
2.6.4 Математическая обработка данных и биоинформатика 51
3 Результаты исследований 52
3.1 Биологическая активность производных 2(5H)-фуранона 52
3.2 Антимикробная активность производного 2(5Н)-фуранона Ф105 в отношении S. aureus 57
3.2.1 Действие производного 2(5Н)-фуранона Ф105 против биопленок S. aureus 57
3.2.2 Синергизм производного 2(5Н)-фуранона Ф105 с различными антибиотиками в отношении S. aureus 60
3.2.3 Механизм антимикробного действия производного 2(5Н)-фуранона Ф105
3.2.3.1 Проникновение аналога Ф105 в бактериальные клетки 63
3.2.3.2 Проникновение аналога Ф105 в биопленку S. aureus 65
3.2.3.3 Индукция Ф105 активных форм кислорода (АФК) 66
3.2.3.4 Влияние Ф105 на мембранный потенциал 67
3.2.3.5 Влияние Ф105 на целостность клеток S. aureus 68
3.2.3.6 Ф105 неспецифично взаимодействует с рядом внутриклеточных белков S. aureus 69
3.3 Антимикробная активность производного 2(5H)-фуранона Ф131 (структурного аналога Ф105) в отношении ротовой микрофлоры 76
3.3.1 Исследование антимикробного действия соединения Ф131 при комбинировании с антибиотиками в отношении Streptococcus spp 80
3.4 Антимикробная активность производного 2(5H)-фуранона Ф123 в отношении B. cereus 83
3.4.1 Синергетический эффект производного 2(5H)-фуранона Ф123 в сочетании с другими антимикробными веществами в отношении B. cereus 85
3.4.2 Оценка развития устойчивости B. cereus к производному 2(5Н)-фуранона Ф123 86
3.4.3 Влияние производного 2(5Н)-фуранона Ф123 на биопленки B. cereus 87
4 Обсуждение результатов 90
Заключение 101
Благодарности 103
Список использованных источников 104
