Введение
1. Введение 6
2. Литературный обзор 8
2.1. Трансмиссивные плазмиды 8
2.2. Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий 10
2.2.1. Три типа систем рестрикции-модификации 12
2.2.2. Системы рестрикции-модификации 1-го типа 15
2.2.2.1. Субъединица узнавания. 18
2.2.2.2. Субъединица модификации 24
2.2.2.3. Модифицирующий фермент 25
2.2.2.4. Субъединица рестрикции 26
2.2.2.5. Комплекс рестрикции-модификации 1-го типа 2S
2.2.3. Системы бактерий, гидролизующие специфически модифицированную ДНК 37
2.3. Системы антирестрикции 37
2.3.1. Антирестрикционная активность бактериофагов 38
2.3.2. Антирестрикциоиные системы, кодируемые трансмиссивными плазмидами 40
3. Материалы и методы 47
3.1. Штаммы E.coli, использованные в работе 47
3.2. Плазмиды и бактериофаги, использованные в работе 48
3.З. Среды для выращивания бактерий и фагов 48
3.3.1. Жидкие среды 48
3.3.2. Твердые среды 49
3.4. Антибиотики, растворы солей и реактивов 50
3.5. Выращивание культур бактерий 51
3.6. Выращивание бактериофагов 51
3.7. Высев бактерий и бактериофагов. Опыты по изучению эффективности рестрикции 52
3.7.1. Высев бактерий 52
3.7.2. Высев бактериофагов , 52
3.7.3. Опыты по изучению эффективности рестрикции 52
3.8. Методы работы с плазмидной ДНК 53
3.8.1, Выделение ДНК малых плазмид для аналитических опытов 53
3.8.2. Очистка плазмид в равновесном градиенте плотпости CsCl 54
3.8.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
3.8.4. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля 55
3.8.5. Рестрищионный анализ плазмид 56
3.8.6. Протокол клонирования фрагментов ДНК в вектор 57
3.9. Получение однотяжевых ДНК-матриц.. 58
3. 10. Фосфорилировапие синтетических олигонуклеотидов 59
3.11. Сайт-направленный мутагенез 59
3.12. Определение нуклеотидиой последовательности ДНК 62
3.12.1.Проведение реакций секвенирования 62
3.12.2.Приготовление сиквепсных гелей. Сиквепсный электрофорез 63
3.13. Получение делеций с помощью Bal 31 нуклеазы 63
3.14. Полимеразная цепная реакция 64
3.15. Мечение фрагмента ДНК при помощи реакции ПЦР 66
3.16. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы 66
3.17. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы с включением S-Met.. 67
3.18. Фракционирование клеточных белков 68
3.19. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 68
3.19.1. Подготовка образцов для анализа 68
3.19.2.Проведение электрофореза. 68
3.20. Замедление подвижности ДНК в геле 69
3.21. Измерение промоторной активности с использованием системы вектора рКК232-8 70
3.22. Очистка белков при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке 71
3.23. Связывание белков in vitro 71
3.24. Определение агрегатного состояния белка ArdA, с использованием метода гель-фильтрации 72
3.25. Ингибирование рестрикции немодифицировашюй ДНК pBR322 in vitro 73
4. Результаты и их обсуждение 74
4.1. Картирование области белка ArdA, существенной для его функционирования с помощью тонкого делеционного анализа 74
4.2. Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования 80
4.3. Изучение взаимодействия [ SJ-меченных белка ArdA и EcoKI метилтрансферазы ш vitro 87
4.4. Определение агрегатного состояния белка ArdA в растворе 92
4.5. Белок ArdA блокирует способность R-M системы 1-го типа связываться со специфической немодифицироваипой ДНК 92 IV.6. Белок ArdA способен ингибировать ЕсоКІ-рестрикцию немодифицированной ДНК/и vitro , 95
4.7. Белок ArdA более эффективно иигибирует рестрикционную, чем модификационную активность EcoKJ-системы in vivo 99
Выводы 104
