Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение 7
2.1. Актуальность проблемы 7
2.2. Цели и задачи исследования 8
2.3. Публикации по теме диссертации 8
2.4. Вклад автора 10
2.5. Положения, выносимые на защиту 11
3. Обзор литературы 12
3.1. Молекулярные факторы вирулентности вирусов 12
3.2. Вирусные гомологи рецепторов tnf и их свойства 19
3.3. Поксвирусные ингибиторы действия интерферонов 26
3.4. Болезни, обусловленные нарушением продукции tnf и ifny 33
3.5. Препараты, ингибирующие действие tnf и ifny 54
3.5.1. Anmu-TNFпрепараты 54
3.5.2. Анти-lFNyпрепараты 60
3.6. Применение вирусных белков для лечения воспалительных и аутоиммунных состояний 63
3.6.1. Вирусные ингибиторы хемокгшов 63
3.6.2. Вирусные ингибиторы комплемента 63
3.6.3. Вирусные аналогихемокинов 64
3.6.4. Вирусные аналоги 1L-10 64
3.6.5. Вирусные ингибиторы сериновых протеаз 65
4. Материалы и методы 66
4.1. Материалы 66
4.1.1. Штаммы бактерий, линии кчеток, вирусы иплазмиды, использованные в работе 66
4.1.2. Ферменты 67
4.1.3. Цитокииы, рецепторы цитокжов, антитела к цитокинам 67
4.1.4. Программное обеспечение 68
4.1.5. Олигонуклеотидные праймеры 68
4.1.6, Буферные растворы, используемые в работе 70
4.2. Методы 70
4.2.1. Культивирование клеток 70
4.2.2. Получение рекомбинантных плазмид 70
4.2.3. Клонирование фрагмента IgGl 71
4.2.4. Получение рекомбинаптиых бакуловирусов 72
4.2.5. Аффинная очистка белков CrmB, CrmB/IgGl ulFNyBP 73
4.2.6. Получение иммунных сывороток и по.тклопальиых кроличьих антител 74
4.2.7. Дот-блот-анализ 76
4.2.8. Электрофорез и вестерн-блот-анализ 77
4.2.9. Твердофазный шшуноферментный анализ 77
4.2.10. Определение биологической активности TNF-связывающих белков 78
4.2.11. Определение биологической активности вирусных IFNyBP 79
4.2.12. Изучение действия CrmB in vivo 81
5. Результаты и обсуждение 84
5.1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей ifny- связывающих белков ортопоксвирусов 84
5.2. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей tnf- связывающих белков ортопоксвирусов 85
5.3. Получение рекомбинаптиых бакуловирусов, продуцирующих mpxv-ifnybp, cpxv-crmb/igg1,varv-crmb/igg1 89
5.4. Экспрессия tnf- и іfny-связыбающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых линии sf21 94
5.5. Очистка рекомбинантных белков 101
5.6. Характеристика рекомбинантных varv-ifnybp и mpxv-ifnybp электофорезомивестерн-блот-анализом 101
5.7. Изучение биологической активности varv-ifnybp и mpxv-ifnybp in vitro 101
5.8. Иммунохимическая характеристика аффинноочищенных рекомбинантных crmb 105
5.8.1. Электрофоретический анализ 105
5.8.2. Вестерн-блот-анализ CrmB 107
5.8.3. ТвердофазныйИФА CrmB 113
5.9. Изучение биологической активности вирусных crmb in vitro 114
5.10. Изучение биологической активности вирусных crmb in vivo 117
5.10.1. Индукция эндотоксического шока 117
5.10.2. Изучение эффектов веедепия рекомбинаптных белков СгтВ интактным мышам и на фоне эндотоксического шока 125
5.10.3. Гистологическое изучение эффектов введениярекомбипаптного белка VARV-СгтВ интактным мышам и па фойе эндотоксического шока 127
5.11. Сравнение crmb с известными антагонистами tnf 128
Выводы 130
