Введение
1. Обзор литературы. Функции ретиноевой кислоты и белка CRABP1 в норме и при опухолевой трансформации 11
1.1. Введение 11
1.2. Физиологические функции ретиноевой кислоты 12
1.3. Метаболизм и транспорт ретиноевой кислоты 14
1.4. Рецепторы ретиноевой кислоты 21
1.5. Роль РК и ее рецепторов в канцерогенезе 26
1.6. Строение и функции белка CRABP1 30
1.7. Влияние CRABP1 на чувствительность опухолевых клеток к РК 35
1.8. Экспрессия CRABP1 в опухолях человека 37
2. Материалы и методы 40
2.1. Растворы, реагенты и среды 40
2.2. Клеточные линии 42
2.3. Характеристика исследованных опухолевых образцов 42
2.4. Выделение нуклеиновых кислот 44
2.4.1 Выделение плазмидной ДНК 44
2.4.2. Выделение РНК из клеточных культур и образцов опухолевых тканей 45
2.4.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 46
2.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 46
2.6. Молекулярное клонирование 47
2.6.1. Получение компетентных клеток E. coli 47
2.6.2 Тран сформация компетентных клеток E.coli 48
2.6.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 48
2.6.4. Реакция лигирования 48
2.6.5. Клонирование кодирующей последовательности гена CRABP1 с кДНК 49
2.6.6. Сайт-направленный му тагенез 50
2.7. Обратная транскрипция РНК 50
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.8.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.8.2. ПЦР в реальном времени 52
2.9. Трансфекция 53
2.10. Инфекция псевдовирусными частицами 54
2.11. Анализ белков 54
2.11.1. Приготовление белковых лизатов 54
2.11.2. Вестерн-блот гибридизация 55
2.12. Исследование клеточных характеристик in vitro 56
2.12.1. Анализ динамики роста клеток 56
2.12.2. Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность) 57
2.12.3. Тест на миграционную активность клеток 57
2.13. Анализ транскрипционной активности белков RAR 57
2.14. Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа 58
2.15. Определение туморогенности 59
2.16. Иммуногистохимический анализ 59
2.17. Статистическая обработка данных 60
3. Результаты 61
3.1. Получение линии HT-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A 62
3.2. Исследование туморогенности полученных линий HT-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A 65
3.3. Исследование транскрипционной активности рецепторов РК - белков RAR, в полученных клеточных линиях 67
3.4. Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro 70
3.4.1. Исследование динамики роста полученных клеточных линий 71
3.4.2. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность) 72
3.4.3. Исследование миграционной активности полученных клеточных линий 73
3.5. Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа 75
3.6. Исследование экспрессии CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком человека 78
3.7. Исследование экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека 80
Обсуждение результатов исследования 86
Выводы 98
Список использованной литературы 99
Приложение 120
