Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Применение ферментов в медицине 8
1.2. Модификация ферментов 10
1.2.1. Функциональные группы белков 11
1.2.2. Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами 12
1.2.3. Модификация синтетическими полимерами 13
1.2.3.1. Системы депонирования белковых лекарств в организме 13
1.2.3.2. Модификация белков монофункциональными полимерами 14
1.2.3.3. Синтетические полифункциональные полимеры 16
1.2.4. Фермент-белковые конъюгаты 16
1.2.5. Проблемы биоконъюгации 19
1.3. Механизмы биологического действия РНКаз 20
1.4. Факторы, необходимые для проявления РНКазами биологического действия .23
1.5. Сывороточный альбумин человека (САЧ) 26
1.5.1. Метаболизм и распределение альбумина 26
1.5.2.1. Аминокислотная последовательность альбумина 27
1.5.2.2. Вторичная структура и доменная организация 29
1.5.2.3. Пространственная структура молекулы альбумина в растворе 30
1.5.2.4. Распределение аминокислотных остатков и зарядов 32
1.5.3. Физико-химические свойства молекулы САЧ 33
1.5.4. Влияние физико-химических факторов на структуру и свойства альбумина 34
1.5.4.1. Влияние значения рН среды 34
1.5.4.2. Денатурация макромолекулы САЧ 37
1.5.4.2.1. Температурная денатурация 37
1.5.4.2.2. Влияние мочевины на структуру САЧ 38
1.5.5. Функции альбумина в организме 38
1.5.5.1. Связывающие центры альбумина 39
1.5.5.1.1. Главные центры неспецифического связывания («лекарственные») 40
1.5.5.1.2. Центр связывания двухвалентных катионов 41
1.5.5.1.3. Тиоловая группа остатка Cys34 41
1.5.5.1.4. Центры связывания неэтерифицированных жирных кислот 41
1.5.5.1.5. «Минорные» центры 43
1.5.5.1.6. Билирубин связывающие центры 43
1.5.6. Группы молекулы САЧ, доступные для химической модификации 44
1.6. Получение конъюгатов ферментов с белками при помощи глутарового альдегида 45
1.6.1. Химическое поведение глутарового альдегида в растворе 45
1.6.2. Взаимодействие ГА с белками 47
1.6.3. Факторы, определяющие успешную иммобилизацию ферментов 50
Глава 2. Экспериментальная часть 53
2.1. Материалы и методы 53
2.2. Характеристика химических реактивов 62
2.3. Характеристика используемых белков 63
2.3.1. Рибонуклеаза из Bacillus Intermedins 7р 63
2.3.2. Бычья панкреатическая рибонуклеаза 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Конъюгаты ферментов с сывороточным альбумином человека, их получение и характеристики .66
3.1.1. Получение и исследование физико-химических свойств безлигандного сывороточного альбумина
человека 66
3.1.2.Способ получения конъюгатов ферментов с БЛСАЧ 74
3.1.3. Исследование физико-химических характеристик конъюгатов и их биологической активности in vitro 80
3.1.3.1. Ферментативная активность конъюгатов 80
3.1.3.2. Определение «молекулярной массы» конъюгатов 83
3.1.3.3. Активность конъюгатов БЛСАЧ и панкреатической РНКазы в отношении двунитевой РНК 84
3.1.4. Способ очистки конъюгатов от примесных агрегатов САЧ 86
3.1.5. Изучение биологической активности конъюгатов in vivo 91
3.1.5.1. Пролонгация действия модифицированного фермента в организме 91
3.1.5.2. Исследование проникновения панкреатической рибонуклеазы через гематоэнцефалический барьер 94
3.2. Компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов БЛСАЧ и РНКазы А...97
3.2.1. Молекулярный докинг обезжиренного альбумина и РНКазы А 97
3.2.2. Анализ поверхности контактов предполагаемых комплексов 101
3.2.3. Анализ влияния взаимодействия РНКазы А и обезжиренного САЧ на активность фермента 103
3.2.4. Анализ структуры центров связывания РНКазы А макромолекулы албьумина 109
3.2.5. Анализ возможных взаимодействий макромолекул в составе полимерного комплекса 111
3.2.6. Гидрофобные взаимодействия 114
3.2.7. Конформационный анализ 117
3.2.8. Предсказание биологической активности БЛСАЧ-модифицированных ферментов (РНКаз) 123
Заключение 128
Выводы 130
Список работ, в которых опубликовано основное содержание диссертации 131
Список цитируемой литературы 133
Приложения 163
