Введение
Обзор литературы 18
1 Лигнинолитические грибы: деструктивный потенциал и физио- 18
логические особенности
1.1 Структура лигнинолитической ферментной системы и деградативные свойства грибов
1.2 Основные условия проявления грибами деструктивной активности и продукции лигнинолитических ферментов
1.3 Индукция продукции внеклеточных ферментов 27
1.3.1 Индукция ионами металлов 27
1.3.2 Органические вещества как индукторы 29
2 Метаболические пути деградации ПАУ лигнинолитическими грибами
2.1 Свойства ПАУ и проблема биодоступности 32
2.2 Ключевые метаболиты деградации ПАУ и продукция лигнино- литических ферментов
2.2.1 Деградация низкомолекулярных ПАУ 37
2.2.1.1 Деградация нафталина 37
2.2.1.2 Деградация фенантрена 39
2.2.1.3 Деградация и трансформация антрацена и антрахиноновых красителей
2.2.1.4 Деградация флуорена 51
2.2.2 Деградация и трансформация высокомолекулярных ПАУ 52
2.2.2.1 Деградация пирена 52
2.2.2.2 Деградация бенз[a]антрацена 56
2.2.2.3 Деградация и трансформация ПАУ с 5 и более конденсированными кольцами
2.2.3 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе деградации ПАУ
3 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов в з процессах микоремедиации 3.1 Микоремедиация как форма биоремедиации 64
3.2 Технологии и подходы микоремедиации 67
3.3 Примеры микоремедиации устойчивых поллютантов 70
3.4 Условия и факторы эффективной микоремедиации 75
3.4.1 Доза внесенного инокулята 76
3.4.2 Концентрация загрязнителя 76
3.4.3 Сопутствующее загрязнение 76
3.4.4 Оптимальные условия колонизации почвы лигнинолитическими 77
3.4.5 Влияние поверхностно-активных веществ 79
3.4.6 Индукция лигнинолитических ферментов 80
3.5 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе микоре- 81 медиации
3.6 Взаимодействие интродуцированных лигнинолитических гри- 84 бов с почвенной микробиотой
3.7 Снижение токсичности и мутагенности почвы в процессе мико- 86 ремедиации
3.8 Возможности и ограничения микоремедиации 88
4 Ключевые ферменты деградации ПАУ лигнинолитическими 91
грибами
4.1 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 91
4.1.1 Лигнин пероксидазы 92
4.1.1.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 92
4.1.1.2 Основные каталитические свойства 94
4.1.2 Mn-зависимые пероксидазы 100
4.1.2.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 100
4.1.2.2 Основные каталитические свойства 102
4.1.3 Гибридные пероксидазы ПО
4.1.3.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл ПО
4.1.3.2 Основные каталитические свойства 111
4.1.4 Лакказы 116 4.1.4.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 117
4.1.4.2 Основные каталитические свойства 120 4.2 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитиче- 138
ских ферментов
4.2.1 Пероксидазы 138
4.2.2 Лакказы 138
Экспериментальная часть 143
5 Материалы и методы 144
5.1 Объекты исследований и методы культивирования 144
5.1.1 Хранение лигнинолитических грибов и получение инокулята 144
5.1.2 Погруженное культивирование грибов 144
5.1.3 Твердофазное культивирование грибов 145
5.2 Исследование деградативной активности грибов 145
5.2.1 Деградация ПАУ 145
5.2.2 Синтетические красители, содержащие конденсированные аро- 145 матические кольца
5.2.3 Изучение деградации нефти в процессе микоремедиации почвы 146
5.3 Определение прироста мицелия 148
5.4 Методы экстракции 148
5.5 Хроматографические методы 149
5.5.1 Газожидкостная хроматография 149
5.5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 149
5.5.3 Тонкослойная хроматография 150
5.5.4 Адсорбционная хроматография 150
5.6 Спектральные методы 151
5.7 Определение эмульгирующей активности 151
5.8 Очистка и характеристика лигнинолитических ферментов 152
5.8.1 Получение грубых препаратов внеклеточных ферментов 152
5.8.2 Получение грубых препаратов «поверхностных» и внутрикле- 152 точных форм ферментов
5.8.3 Схема очистки лакказ и пероксидазы из погруженной культуры 153 P. ostreatus D1 5.8.4 Очистка лакказ из твердофазных культур P. ostreatus D1 и 154 Agaricus sp. F-8
5.8.5 Гибридная пероксидаза Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. 155
5.8.6 Определение активности ферментов 155
5.8.7 Определение каталитических характеристик ферментов 159
5.8.8 Ферментативное окисление ПАУ 159
5.8.9 Электрофорез 160
5.8.10 Определение молекулярных масс ферментов 160
5.9 Реактивы и материалы 161
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 163
6 Особенности метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами 163
6.1 Деградация ПАУ с тремя конденсированными кольцами 163
6.1.1 Фенантрен 163
6.1.1.1 Скрининг грибов на способность деградировать фенантрен и 163 продуцировать лигнинолитические ферменты
6.1.1.2 Деградация фенантрена при культивировании P. ostreatus D1 на 164 среде Кирка
6.1.1.3 Деградация фенантрена при культивировании P. ostreatus D1 на 172 богатой среде для базидиомицетов
6.1.1.4 Деградация фенантрена подстилочным сапротрофом Agaricus 175 sp. F-8
6.1.2 Антрацен и синтетические красители 177
6.1.2.1 Деградация антрацена грибом белой гнили P. ostreatus D1 177
6.1.2.2 Деградация антрацена подстилочным сапротрофом Agaricus sp. 182 F-8
6.1.2.3 Обесцвечивание синтетических красителей P. ostreatus D1 183
6.1.3 Деградация флуорена P. ostreatus D1 184
6.2 Деградация ПАУ с четырьмя конденсированными кольцами 189
6.2.1 Деградация пирена P. ostreatus D1 189
6.2.2 Деградация хризена P. ostreatus D1 196
6.2.3 Деградация флуорантена P. ostreatus D1 199
6.3 Деградация основных метаболитов ПАУ P. ostreatus D1 202 6.4 Продукция эмульгирующего вещества в процессе деградации 204
ПАУ P. ostreatus D1
7 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 208
7.1 Лакказы гриба белой гнили P. ostreatus D1 и подстилочного са- 208
протрофа Agaricus sp. F-8
7.1.1 Очистка и характеристика лакказ из погруженной культуры P. 208
ostreatus D1
7.1.1.1 Продукция и очистка лакказ 208
7.1.1.2 Молекулярные свойства лакказы-1 210
7.1.1.3 Каталитические свойства лакказы-1 211
7.1.1.4 Очистка и характеристика минорных лакказ 222
7.1.2 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры P. 224
ostreatus D1
7.1.2.1 Подбор условий твердофазного культивирования гриба для получения лакказы
7.1.2.2 Очистка «желтой» лакказы 224
7.1.2.3 Молекулярные свойства «желтой» лакказы 226
7.1.2.4 Каталитические свойства «желтой» лакказы 227
7.1.3 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры 240
Agaricus sp. F-8
7.1.3.1 Продукция лакказы и ее очистка 241
7.1.3.2 Молекулярные свойства 244
7.1.3.3 Каталитические свойства 245
7.2 Пероксидазы грибов белой гнили Pleurotus ostreatus D1 и Bjer- 248
kandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.
7.2.1 Характеристика гибридной пероксидазы B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) 248 Karst.
7.2.2 Очистка и характеристика пероксидазы P. ostreatus D1 264
7.2.2.1 Молекулярные свойства 265
7.2.2.2 Каталитические свойства 266
7.2.3 Обесцвечивание антрахиноновых красителей пероксидазами P. 272
ostreatus D1 и B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.
8 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитичских ферментов гриба P. ostreatus D1
8.1 Влияние ПАУ на баланс внеклеточных, «поверхностных» и 279 внутриклеточных форм ферментов
8.2 Лакказы 283
8.2.1 «Поверхностные» формы лакказ: очистка и характеристика 283
8.2.2 Внутриклеточные лакказы: очистка и характеристика 287 8.2 Внутриклеточная пероксидаза: очистка и характеристика 292
9 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 для микоремедиации нефтеза грязненной почвы
9.1 Скрининг лигнинолитических грибов по способности к деграда- 295 ции нефти
9.2 Исследование деградации нефти в условиях погруженного куль- 296 тивирования грибов
9.2.1 Деградация нефти при росте грибов на разных средах 296
9.2.2 Влияние рН на деградацию нефти P. ostreatus D1 298
9.2.3 Влияние поверхностно-активных веществ на деградацию нефти 299 P. ostreatus D1
9.2.4 Продукция лигнинолитических ферментов P. ostreatus D1 в присутствии нефти
9.3 Деградация ПАУ и других углеводородов нефти при культиви- 302
ровании лигнинолитических грибов в почве
9.3.1 Деградативная активность грибов белой гнили в почве 302
9.3.2 Деградация нефти в почве грибом P. ostreatus D1 303
9.3.2.1 Влияние интродуцированного мицелия P. ostreatus D1 на почвенную микрофлору
9.3.2.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микоремедиации почвы P. ostreatus D1
9.4 Микоремедиация почвы со старым нефтяным загрязнением подстилочным сапротрофом Agaricus sp. F-8
9.4.1 Рост гриба Agaricus sp. F-8 в загрязненной почве 311
9.4.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микореме- 312
диации почвы Agaricus sp. F-8
9.5 Продукция внеклеточных лигнинолитических ферментов в процессе микоремедиации нефтезагрязненной почвы
9.5.1 Деградативная активность лигнинолитических грибов в почве со старым нефтяным загрязнением
9.5.2 Продукция лакказ в процессе микоремедиации 317
9.5.3 Продукция пероксидаз в процессе микоремедиации 319
9.5.4 Модификация состава ароматических фракций в процессе микоремедиации
9.6 Грибы P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 как перспективные кандидаты для создания эффективной технологии микоремедиации
Заключение 324
Выводы 334
Список сокращений 336
Список литературы
