Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 11
1.1.1. Иммобилизованные клетки в биотехнологии 11
1.1.2. Методы иммобилизации мицелиальных грибов 12
1.1.3. Общая характеристика криогеля поливинилового спирта как носителя для иммобилизации клеток 14
1.1.4. Свойства иммобилизованных клеток 18
1.2. Молочная кислота 22
1.2.1. Практическое значение молочной кислоты и ее производных 22
1.2.2. Химические методы получения молочной кислоты 25
1.2.3. Микробиологические способы получение молочной кислоты 26
1.2.3.1. Бактериальные продуценты молочной кислоты 26
1.2.3.2. Мицелиальные грибы - продуценты молочной кислоты 31
1.2.3.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованных грибов -продуцентов молочной кислоты 37
1.3. Липолитические ферменты 42
1.3.1. Общая характеристика липолитических ферментов 43
1.3.2. Влияние различных факторов на биосинтез липаз мицелиальных грибов 51
1.3.3. Иммобилизованные грибные продуценты липолитических ферментов 53
1.3.4. Проблемы очистки сточных вод, содержащих вещества липидной природы 57
Глава II. Материалы и методы исследования 62
2.1. Материалы 62
2.1.1. Химические реактивы 62
2.1.2. Микроорганизмы 63
2.2. Методы 63
2.2.1. Хранение культур грибов 63
2.2.2. Выращивание и хранение культур бактерий 63
2.2.3. Иммобилизация спорового материала и биомассы бактерий в криогель ПВС 64
2.2.4. Сбраживание глюкозосодержащей среды свободными и иммобилизованными клетками бактерий в периодическом реакторе 65
2.2.5. Культивирование клеток гриба R. oryzae
в процессах получения молочной кислоты 66
2.2.6. Определение амилазной активности 68
2.2.7. Определение концентрации глюкозы 69
2.2.8. Определение динамической вязкости растворов по методу Оствальда 70
2.2.9. Определение концентрации молочной кислоты 70
2.2.10. Определение концентрации крахмала 71
2.2.11. Определение сухого веса биомассы 72
2.2.12. Определение концентрации внутриклеточного АТР биолюминисцентным методом 72
2.2.13. Культивирование клеток гриба R. oryzae
в процессах биосинтеза внеклеточных липолитических ферментов 73
2.2.14. Определение активности липазы модифицированным методом Олфорда и Пирса 75
2.2.15. Определение ХПК 76
2.2.16. Хроматографическое разделение комплекса липолитических ферментов, секретируемых свободными и иммобилизованными клетками гриба R. oryzae 77
2.2.17. Электронная и световая микроскопия образцов гранул 78
2.2.18. Электрофоретический анализ белков 78
2.2.19. Исследование реологических характеристик гранул, полученных на основе криогеля поливинилового спирта 78
2.2.20. Определение кинетических параметров процессов с использованием свободных и иммобилизованных клеток 79
Глава III. Результаты и обсуждение 84
3.1. Биокатализатор для получения молочной кислоты: условия формирования и свойства 84
3.1.1. Скрининг культур по соотношению синтезируемых ими L- и D-изомеров молочной кислоты 84
3.1.2. Получение молочной кислоты при использовании свободных и иммобилизованных клеток бактерий ; 86
3.1.2.1. Кинетические характеристики сбраживания глюкозы свободными бактериальными клетками 86
3.1.2.2. Молочнокислое брожение в реакторе периодического действия с использованием концентрированных суспензий клеток L. casei 88
3.1.2.3. Молочнокислое брожение в реакторе периодического действия с использованием иммобилизованных клеток бактерий L. casei 90
3.1.3. Получение молочной кислоты при использовании свободных и иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 92
3.1.3.1. Продуцирование молочной кислоты свободными клетками R. oryzae 92
3.1.3.2. Получение молочной кислоты иммобилизованными клетками R. oryzae в процессе формирования биокатализатора при использовании питательных сред различного состава 94
3.1.3.2.1. Формирование биокатализатора при использовании питательной среды с глюкозой 94
3.1.3.2.2. Формирование биокатализатора при использовании крахмалосодержащей питательной среды 98
3.1.3.2.3. Сравнительный анализ процессов формирования биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae, выбор оптимальных условий 100
3.1.3.3. Получение молочной кислоты при использовании биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 103
3.1.3.3.1. Получение молочной кислоты в периодическом процессе с использованием питательной среды, содержащей глюкозу 104
3.1.3.3.2. Накопление молочной кислоты в режиме периодического процесса с подпитками субстратом — глюкозой 108
3.1.3.3.3. Получение молочной кислоты в периодическом процессе при использовании кислотных гидролизатов крахмала 110
3.1.3.3.4. Получение молочной кислоты при использовании кислотных гидролизатов крахмала в периодическом процессе с подпитками субстратом 112
3.1.3.3.5. Получение молочной кислоты в периодическом процессе при использовании клейстеризованного крахмала 114
3.1.4. Анализ параметров процесса получения молочной кислоты с использованием биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 118
3.2. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, секретирующих липолитические ферменты 124
3.2.1. Скрининг продуцентов липаз среди штаммов гриба Rhizopus oryzae для разработки биокатализатора на основе иммобилизованных клеток 124
3.2.2. Влияние состава питательной среды на формирование свободного и иммобилизованного мицелия, секретирующего липазы 126
3.2.3. Влияние различных факторов на результаты многократного использования
иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, продуцирующих липазы 134
3.2.3.1. Влияние состава среды на липолитическую активность внеклеточных ферментов, секретируемых иммобилизованными клетками гриба 134
3.2.3.2. Характеристики биокатализатора на основе клеток гриба иммобилизованных в криогеле ПВС R. oryzae, осуществляющих биосинтез внеклеточных липолитических ферментов 142
3.2.4. Анализ комплексов липолитических ферментов, секретируемых свободными и иммобилизованными клетками гриба R. oryzae 144
3.2.5. Исследование возможности использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae для очистки сточных вод, содержащих вещества липидной природы 149
Заключение 153
Выводы 155
Список литературы
