ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 11
1.1 История распространение ВГП ........................................................................... 11
1.2 Классификация ..................................................................................................... 12
1.3 Морфология .......................................................................................................... 14
1.4 Жизненный цикл вируса ...................................................................................... 16
1.5 Изменчивость вируса гриппа птиц ...................................................................... 18
1.6 Физико-химические свойства вируса гриппа птиц ............................................ 19
1.7 Клинические признаки ......................................................................................... 20
1.8 Лабораторная диагностика гриппа птиц ............................................................. 22
1.8.1 Отбор и подготовка проб .................................................................................. 23
1.8.2 Вирусологические методы ................................................................................ 25
1.8.3 Молекулярная диагностика .............................................................................. 26
1.8.4 Серологические методы .................................................................................... 30
1.9 Профилактика и контроль заболевания .............................................................. 32
1.10 Распространение ВГП подтипа H5 в мире ........................................................ 34
1.11 Распространение ВГП подтипа H7 в мире ........................................................ 36
1.12 Заключение по обзору литературы.................................................................... 40
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................... 42
2.1 Материалы ............................................................................................................ 42
2.2 Методы .................................................................................................................. 45
2.2.1 Выделение вируса из проб патологического материала ................................. 45
2.2.2 Реакция торможения гемагглютинации ........................................................... 47
2.2.3 Реакция торможения нейраминидазной активности ....................................... 48
2.2.4 Определение титра инфекционной активности ............................................... 50
2.2.5 Определение индекса патогенности ................................................................. 50
2.2.6 Инактивация вируса гриппа птиц ..................................................................... 51
2.2.7 Получение положительных (гипериммунных) и нормальной сывороток
крови кур к вирусу гриппа птиц ................................................................................ 51
2.2.8 Выделение суммарной РНК .............................................................................. 52
2.2.9 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме
реального времени ..................................................................................................... 53
2.2.9 Статистическая обработка результатов ........................................................... 53
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ......................................... 54
3.1 Разработка тест-системы для выявления РНК вируса гриппа птиц типа А
методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени .................. 54
3.1.1 Выбор системы праймеров и зонда .................................................................. 54
3.1.2 Подбор оптимальной концентрации праймеров .............................................. 55
3.1.3 Подбор оптимальной концентрации флуоресцентного зонда ........................ 56
3.1.4 Подбор оптимальной концентрации хлорида магния в ОТ-ПЦР-РВ ............. 57
3.1.5 Подбор оптимальной концентрации внутреннего контрольного образца ..... 58
3.1.6 Оптимизация температурно-временных параметров ...................................... 59
3.1.7 Определение основных валидационных характеристик «Тест-системы для
выявления РНК вируса гриппа птиц типа А методом полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени»..................................................................... 60
3.1.8 Определение срока годности тест-системы ..................................................... 63
3.1.9 Выявление генома вируса гриппа птиц в пробах биоматериала .................... 64
3.2 Выделение вирусов гриппа птиц ......................................................................... 65
3.2.1 Идентификация подтипа вируса гриппа птиц по гемагглютинину и
нейраминидазе ............................................................................................................ 70
3.2.2 Изучение биологических свойств выделенных изолятов ВГП ....................... 74
3.2.3 Молекулярно-генетические свойства изолятов ............................................... 75
3.2.4 Определение инфекционной активности изолятов ВГП ................................. 78
3.2.5 Адаптация вирусов к культивированию в СПФ-КЭ........................................ 79
3.2.6 Проверка стабильности биологических свойств ............................................. 81
3.2.7 Определение антигенных свойств вирусов ...................................................... 82
Препараты антигенов ВГП ........................................................................................ 84
3.2.8 Определение вирулентных свойств вирусов ................................................... 85
3.3 Разработка набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипов H5
и H7 в реакции торможения гемагглютинации ........................................................ 88
3.3.2 Получение антигенов ВГП................................................................................ 89
3.3.1 Определение оптимальных условий для накопления вируса ......................... 91
3.3.3 Получение положительной и нормальной контрольных сывороток крови ... 94
3.3.4 Оценка основных валидационных характеристик «Набора для выявления
антител к вирусу гриппа птиц подтипов H5 и H7 в РТГА ....................................... 95
3.3.5 Определение условий хранения компонентов набора .................................... 99
3.3.6 Выявление антител к вирусу гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в полевых
сыворотках крови птиц ............................................................................................ 102
4 ОБСУЖДЕНИЕ ..................................................................................................... 103
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 105
5.1 Выводы ............................................................................................................... 105
5.2 Практические предложения ............................................................................... 106
5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы ..................................................... 106
6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .......................... 107
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................... 109
8 ПРИЛОЖЕНИЯ ..................................................................................................... 131
