Введение
1. Литературный обзор 13
1.1. Биохимическое потребление кислорода (БПК) 13
1.1.2. Методы определения БПК5 14
1.1.2.1 Стандартный метод 18
1.1.2.2 Фотометрический метод 20
1.1.2.3 Манометрический метод 20
1.2 Методы определения БПК с использованием биосенсоров 21
1.2.1 Типы БПК-биосенсоров в зависимости от вида преобразователя 22
1.2.1.1 Биосенсоры на основе биолюминисцентных бактерий 22
1.2.1.2 Микробные биотопливные элементы 23
1.2.1.3 Амперометрические БПК-биосенсоры 23
1.2.1.3.1 Электрохимические БПК-биосенсоры на основе редокс медиаторов 24
1.2.3.1.2 Амперометрические БПК-биосенсоры на основе
кислородного электрода 24
1.2.2 Тип биологического материала используемого в БПК биосенсорах 25
1.2.2.1 Биосенсоры на основе индивидуальных культур 26
1.2.2.2 Биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмов 31
1.2.3 Коммерческие БПК-биосенсоры 34
1.3 Особенности биохимии дрожжевых клеток 39
1.3.1 Особенности дрожжей Debaryomyces hansenii 41
1.3.1.1 Строение дрожжей Debaryomyces hansenii 44
1.3.1.2 Влияние солености среды на дрожжи D. hansenii 46
1.3.1.3 Применение дрожжей D. hansenii 47
1.3.2 Особенности дрожжей Arxula adeninivorans 49
1.4 Методы иммобилизации клеток 51
1.4.1 Иммобилизация клеток путем включения в массу носителя 54
1.4.2 Гидрогели 56
1.4.3 Использование гидрогелей в биодатчиках 57
1.4.5 Гидрогели в биосенсорах 58
1.4.6 Биосенсоры на основе ферментов, иммобилизованных в гидрогели 58
1.4.7 Биосенсоры на основе целых клетокмикроорганизмов, иммобилизованных в гидрогели 59
2. Экспериментальная часть 63
2.1 Получение поливинилового спирта, модифицированного N винилпирролидоном 63
2.2 Регистрация ИК-спектров 63
2.3 Регистрация ЯМР-спектров модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ 64
2.4 Определение доли сшитого поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном 64
2.5 Культивирование клеток микроорганизмов 65
2.6 Проведение биосенсорных измерений 66
2.7 Заполнение и проверка качества электрода Кларка 67
2.8 Иммобилизация дрожжей с применением диализной мембраны 68
2.9 Иммобилизация микроорганизмов в гидрогель модифицированного поливинилового спирта 69
2.10 Определение ростовых параметров микроорганизмов 69
2.11 Сканирующая электронная микроскопия 69
2. 12 Определение БПК5 стандартным методом разбавления 70
3. Обсуждение результатов 71
3.1. Выбор биологического материала для создания БПК-биосенсора на основе индивидуальной культуры микроорганизмов 71
3.2 Составление искусственных ассоциаций микроорганизмов 74
3.2.1 Кривые роста дрожжей 75
3.2.2 Изучение стабильности во времени созданных ассоциаций 79
3.3 Разработка матрицы на основе гидрогеля поливинилового спирта модифицированного N-винилпирролидоном, подходящей для иммобилизации микроорганизмов 81
3.3.1 Влияние соотношения компонентов и времени синтеза на долю сшитого полимера 82
3.3.2 ИК-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта 83
3.3.3 ЯМР-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ 87
3.4 Иммобилизация дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 в гидрогель поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном 101
3.4.1 Зависимость ответа биосенсора от биохимического потребеления кислорода 104
3.3.2. Нижняя граница определяемых содержаний и предел обнаружения 109
3.4.3. Рабочий диапазон 110
3.4.4 Операционная стабильность 111
3.4.5 Долговременная стабильность 113
3.4.6 Основные характеристики разработанных биочувствительных элементов на основе дрожжей иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт 119
3.4.7 Субстратная специфичность дрожжей Debaryomyces hansenii,
иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный N винилпирролидоном 120
3.5 Иммобилизация ассоциаций микроорганизмов 123
3.6 Влияние состава исследуемых проб на окислительную способность дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциации дрожжей O. angusta, A. adeninivorans, D. hansenii 131
3.6.1 Влияние pH-среды 131
3.6.2 Определение зависимости окислительной активности дрожжей от температуры среды 132
3.6.3 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе хлорида натрия 135
3.6.4 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе ионов тяжелых металлов 138
3.7 Анализ образцов воды 141
3.8 Использование результатов исследования для создания экспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт – 009» 144
Выводы 152
Список опубликованных научных работ по теме диссертации 154
Список литературы 157
