Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Ферменты – природные биокатализаторы 13
1.1.1. Общие представления о ферментах 13
1.1.2. Механизм действия ферментов 17
1.1.3. Кинетика ферментативных реакций. Определение параметров эффективности ферментативного катализа
1.2. Гетерогенный биокатализ 25
1.2.1. Иммобилизация ферментов и особенности гетерогенного биокатализа 25
1.2.2. Влияние иммобилизации ферментов на их свойства 26
1.2.3. Способы создания гетерогенных биокатализаторов
1.2.3.1. Физические методы иммобилизации 28
1.2.3.2. Химическая иммобилизация 30
1.2.4. Носители для иммобилизации ферментов 37
1.3. Монолитные макропористые материалы как носители 41
для иммобилизации ферментов и стационарные фазы для ВЭЖХ
1.3.1. Синтез макропористых монолитных материалов 42
1.3.2. Влияние параметров синтеза на поровую структуру монолитов 43
1.3.3. Методы исследования поровой структуры макропористых монолитов 46
1.3.4. Применение макропористых монолитных материалов
1.4. Хроматографические реакторы: комбинирование биокатализа и сепарации 51
1.5. Применение гетерогенных биокатализаторов 56
1.5.1. Рибонуклеаза А 57
1.5.1.1. Характеристика фермента 57
1.5.1.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе рибонуклеазы А 60
1.5.2. Ксиланолитические ферменты 61
1.5.2.1. -ксиланаза 63
1.5.2.2. -ксилозидаза 65
1.5.2.3. Гетерогенные биокатализаторы на основе 66 ксиланолитических ферментов
1.5.3. Эстераза 68
1.5.3.1. Характеристика фермента 69
1.5.3.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе эстеразы 70
2. Экспериментальная часть 74
2.1. Материалы 74
2.2. Оборудование 75
2.3. Методы 76
2.3.1. Получение макропористых монолитных материалов 76
2.3.1.1. Синтез макропористых монолитных носителей для иммобилизации ферментов
2.3.1.2. Синтез макропористых монолитных колонок для хроматографии 78
2.3.1.3. Изучение свойств монолитных матриц 79
2.3.2. Иммобилизация ферментов на поверхности полимерного носителя 80
2.3.2.1. Прямая иммобилизация 80
2.3.2.2. Иммобилизация через полимерный спейсер 80
2.3.2.3. Определение количества иммобилизованного фермента 83
2.3.3. Определение кинетических параметров биокаталитических реакций 83
2.3.3.1. Рибонкулеаза А 84
2.3.3.2. -ксилозидаза 85
2.3.3.3. -ксиланаза 86
2.3.3.4. Эстераза 87
2.3.4. Off-line мониторинг образования продуктов деградации 87
высокомолекулярных субстратов
2.3.4.1. Деградация высокомолекулярных субстратов 88
2.3.4.1.1. Деградация полицитидиловой кислоты 88
2.3.4.1.2. Деградация РНК 88
2.3.4.1.3. Деградация РНК в многокомпонентной смеси 89
2.3.4.1.4. Деградация ксилана -ксиланазой 89
2.3.4.1.5. Деградация ксилана -ксилозидазой 90
2.3.4.1.6. Деградация ксилана с помощью биферментной системы 90
2.3.4.1.7. Деградация поли(молочной кислоты) 90
2.3.4.1.8. Деградация наночастиц на основе поли(молочной кислоты) 91
2.3.4.2. ВЭЖХ мониторинг 91
2.3.5. On-line мониторинг образования продуктов деградации высокомолекулярных субстратов
2.3.5.1. Хроматографический реактор на основе рибонуклеазы А 93
2.3.5.2. Хроматографический реактор на основе комплекса ксиланолитических ферментов
3. Результаты и обсуждение 95
3.1. Получение макропористых монолитных носителей для 9 иммобилизации ферментов
3.2. Получение макропористых монолитных стационарных фаз для хроматографического анализа
3.3. Иммобилизация ферментов на поверхности макропористых монолитных носителей
3.4. Изучение влияния различных факторов на эффективность гетерогенного биокатализа
3.4.1. Влияние природы поверхности материала-носителя 117
3.4.2. Влияние метода иммобилизации фермента 118
3.4.3. Влияние геометрии стационарной фазы 122
3.4.4. Влияние скорости потока раствора субстрата сквозь гетерогенный биокатализатор
3.4.5. Влияние количества иммобилизованного фермента 128
3.5. Изучение деградации природных и синтетических полимеров 131
с использованием разработанных гетерогенных биокатализаторов
3.5.1. Разработка метода хроматографического мониторинга поли- и олигонуклеотидов
3.5.2. Изучение ферментативной деградации полицитидиловой кислоты 135
3.5.3. Изучение ферментативной деградации РНК 140
3.5.4. Изучение ферментативной деградации ксилана 143
3.5.5. Изучение ферментативной деградации поли(молочной кислоты) 148
3.6. Разработка хроматографических биокаталитических реакторов и изучение 152
возможности их применения в процессах биотехнологии
3.6.1. Разработка хроматографического биокаталитического реактора на основе рибонуклеазы А
3.6.2. Разработка хроматографического биокаталитического реактора на основе ксиланолитических ферментов
3.6.3. Использование гетерогенных биореакторов для изучения процессов 160 деградации медицинских материалов на основе биодеградируемых полимеров
Выводы 162
Список литературы
