Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Феноменологическая теория, рассматривающая роль ионного баланса в делении клетки 16
1.2. Регуляция калиевого баланса клетки в митозе 21
1.3. Регуляция натриевого баланса клетки в митозе 29
1.4. Энергетический статус клетки раннего эмбриона млекопитающих 36
1.5. Принципы электронно-зондового микроанализа (ЕРМА) 46
1.5.1. Криофиксация элементного состава клетки . 46
1.5.2. Метод freeze-drying 53
1.5.3. Физико-технические основы ЕРМА 55
1.5.4. Расчет концентрации элементов на срезе клетки по данным ЕРМА 58
1.5.5. ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов в одиночной клетке культуры и суспензии 60
ГЛАВА 2. Методы и объекты исследования 74
2.1. Получение ооцитов и ранних эмбрионов мыши 74
2 Л. 1. Суперовуляция мыши 74
2.1.2. Выделение яйцеводов мыши 75
2.1.3. Вымывание ранних эмбрионов мыши 76
2.1.4. Получение ооцитов мыши в метафазе II мейоза 77
2.1.5. Получение зигот мыши в фазах первого клеточного цикла 78
2.1.6. Получение двухклеточных эмбрионов мыши 80
2.2. Методы клеточных биотехнологий 81
2.2.1. Эквилибрация и отмывка эмбриона от криопротектора 81
2.2.2. Энуклеация зиготы мыши 83
2.2.3. Получение культуры нейральных стволовых клеток человека (нейросфер) 84
2.2.4. Обработка одноклеточного эмбриона мыши цитохалазином D 85
2.2.5. Подготовка одноклеточного эмбриона мыши для конфокальной микроскопии F-актина 87
2.3. Технология ЕРМА для раннего эмбриона мыши 89
2.3.1. Получение полутонких срезов раннего эмбриона мыши 89
2.3.2. ЕРМА внутриклеточной концентрации элементов 95
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 98
3.1. Особенности технологии ЕРМА применительно к раннему эмбриону мыши 98
3.1.1. Подготовка 2 мкм срезов раннего эмбриона мыши для ЕРМА 99
3.1.2. Эмпирический метод определения поправочного коэффициента в уравнении расчета концентрации элементов 104
3.2. Измерение концентрации элементов в клетках раннего эмбриона мыши 108
3.2.1. Сравнение групп ооцитов в метафазе II мейоза и зигот мыши по цитоплазматической концентрации калия и фосфора 108
3.2.1.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) по группам ооцитов и зигот мыши 109
3.2.1.2. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме ооцитамыши 112
3.2.1.3. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме зиготы мыши 113
3.2.2. Определение цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши 116
3.2.2.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) на разных стадиях развития зиготы мыши 116
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в Gi-фазе зиготы мыши 117
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р)в Gi/S-фазе зиготы мыши 121
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элемент.ов (К,.Е):в.8-фазе зиготы мыши 128
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К,Р)в Ог-фазе зиготы мыши 132
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в профазе митоза зиготы мыши 138
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в телофазе митоза зиготы мыши 143
3.2.2.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши 146
Изменения концентрации цитоплазматического калия в течение первого клеточного цикла мыши 146
Пространственное распределение цитоплазматического калия в разных фазах первого клеточного цикла 153
Оценка эффективного коэффициента диффузии калия в Gi/S-фазе зиготы мыши 156
Модель калийобусловленной полимеризации актина и механизма аккумуляции калия в цитоплазме зиготы мышы 159
Гипотеза о механизме участия актина в сближении пронуклеусов в зиготе мыши 165
3.2.3. Определение концентрации элементов (К, Р, Na) в цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона мыши 178
3.2.3.1. Результаты ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Р) в двухклеточном эмбрионе мыши. 178
3.2.3.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Р, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши 183
3.3. Применение ЕРМА для контроля клеточных биотехнологий...185
3.3.1. Анализ двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации при криоконсервировании 185
3.3.1.1. Принципы криоконсервирования ранних эмбрионов млекопитающих 186
3.3.1.2. Результаты ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши после эквилибрации/отмывки 193
3.3.1.3. Обсуждение результатов ЕРМА в эксперименте эквилибрации/отмывки этиленгликоля в двухклеточном эмбрионе мыши 194
3.3.2. Анализ одноклеточного эмбриона мыши после энуклеации... 196
3.3.3. Анализ клоногенной нейросферы человека 198
Заключение .207
Выводы 211
Литература 213
