Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Денитрификация 14
1.1.1. Общая характеристика процесса 14
1.1.2. Молекулярно-биологические аспекты дыхания на нитратах 18
1.1.3. Нитратное дыхание 21
1.1.3.1. Нитратредуктазы прокариот 22
1.1.3.1.1.Определение, классификация 22
1.1.3.1.2. Каталитические свойства. Механизм восстановления нитрата до нитрита 23
1.1.3.1.3. Клеточная локализация 24
1.1.3.1.4. Ассимиляционные нитратредуктазы 24
1.1.3.1.5. Диссимиляционные нитратредуктазы 25
1.1.3.1.5.1. Мембраносвязанная респираторная нитратредуктаза 25
1.1.3.1.5.2. Периплазматическая нитратредуктаза 26
1.1.4. Транспорт нитратов 27
1.1.5. Дыхание на нитритах. Нитритредуктазы 28
1.1.6. NO- и N2O-редуктазы 29
1.2. Диссимиляционная нитратредукция до аммония 31
1.3. АНАММОКС 34
1.4. Диссимиляционная нитратредуктаза NarGHI 35
1.4.1. Распространение 35
1.4.2. Функции 36
1.4.3. Особенности структурной организации 37 3
1.4.4. Физико-химические свойства 40
1.4.5. Устройство генного кластера nar, сборка фермента, регуляция экспрессии 44
1.5. Характеристика рода Thiothrix 46
1.5.1. Таксономический состав и филогенетическое положение 48
1.5.2. Экология 53
1.6. Заключение по обзору литературы 54
ГЛАВА 2. Методы исследования 56
2.1. Материалы, приборы, реактивы, инретнет-ресурсы 56
2.1.1. Использованные реактивы 56
2.1.2. Буферные растворы и реакционные смеси 56
2.1.3. Препараты ДНК 57
2.1.4. Белковые маркеры 57
2.1.5. Оборудование, программы, интернет-ресурсы 59
2.1.5.1. Оборудование 59
2.1.5.2. Программы и интернет-ресурсы 59
2.2. Микроорганизмы и их культивирование 59
2.2.1. Объекты исследования 59
2.2.2. Состав сред и условия культивирования 60
2.3. Молекулярно-биологические методы 61
2.3.1. Выделение геномной ДНК 61
2.3.2. ПЦР-амплификация ДНК 61
2.3.3. Очистка фрагментов ПЦР с помощью препаративного электрофореза61
2.3.4. Выделение суммарной клеточной фракции РНК 63
2.3.5. Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции) и ОТ-ПЦР 63
2.3.6. Определение нуклеотидной последовательности 64
2.3.7. Построение филогенетического дерева 64
2.4. Химические методы анализа 64
2.4.1. Анализ анионов 64
2.5. Методы определения активности ферментов 65
2.5.1. Определение активности нитратредуктазы 65
2.5.1.1. Получение бесклеточного экстракта 65
2.5.1.2. Определение активности нитратредуктазы 66
2.6. Очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы 66
2.6.1. Очистка фермента 66
2.6.2. Определение молекулярной массы нативного препарата респираторной нитратредуктазы 67
2.6.3. Определение молекулярной массы субъединиц 68
2.6.4. Определение оптимума рН, температурного оптимума и термостабильности 69
2.6.5. Определение кинетических свойств нитратредуктазы NarGHI 70
2.7. Определение концентрации белка 70
2.8. Статистическая обработка результатов 70
ГЛАВА 3. Результаты исследований 71
3.1. Биохимия нитратного дыхания у представителей серобактерий рода Thiothrix 71
3.1.1. Анаэробный рост и динамика восстановления нитратов и образования нитритов при анаэробном дыхании на нитратах 71
3.1.2. Определение активности диссимиляционной нитратредуктазы 73
3.1.3. Очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы T. lacustris AS 74
3.1.3.1. Очистка респираторной нитратредуктазы NarGHI 74
3.1.3.2. Молекулярные свойства мембраносвязанной нитратредуктазы 76
3.1.3.3. Физико-химические свойства респираторной нитратредуктазы 77
3.1.3.4. Кинетические и регуляторные свойства мембраносвязаной нитратредуктазы 79
3.1.3.5. Детекция гена narG, кодирующего респираторную нитратредуктазу 81
3.1.3.6. Экспрессия гена narG 85
3.1.3.7. Филогенетический анализ последовательностей гена narG 87
3.2. Исследование метаболических путей восстановления нитрита при анаэробном дыхании у представителей рода Thiothrix 89
3.2.2. Скрининг функциональных генов, участвующих в диссимиляционных реакциях восстановления нитритов, окиси и закиси азота 90
3.2.2.1. Детекция нитритредуктазы 90
3.2.2.2. Детекция NO-редуктазы и N2O-редуктазы 96
3.3. Связь экологических наблюдений с молекулярно-биологическими исследованиями 100
ГЛАВА 4. Обусждение результатов 103
4.1. Схема очистки респираторной нитратредуктазы и особенности полученного препарата белка 103
4.1.2. Разработка схемы очистки фермента и обоснование использования конкретных методов 104
4.2. Особенности диссимиляционной нитратредукции у представителей рода Thiothrix 108
Выводы 113
Список литературы
