Введение
Для получения необходимого для функциональных тестов материала была разработана система получения рекомбинантного токсина OtTx 1a в культуре E. coli. Поскольку токсин содержит 5 дисульфидных связей, его получали в виде химеры с белком-помощником тиоредоксином (Trx-OtTx 1a), который in vivo способствует формированию правильной пространственной укладки у дисульфид-богатых белков. Для того чтобы снизить возможную мембранолитическую активность N-концевого домена OtTx 1a, в состав химерного белка был введен природный пропептид из белкового предшественника OtTx 1a. В связи с тем, что зрелый OtTx 1a не содержит остатков метионина, использовалось специфическое расщепление с помощью BrCN по остатку метионина, искусственно введенному между последовательностями пропептида и OtTx 1a. Химерный белок Trx-OtTx 1a также содержал последовательность из 6 остатков гистидина, позволившую очищать белок методом металл-хелатной аффинной хроматографии. Схема химерного белка приведена на рис. 7, А. После расщепления химерного белка BrCN целевой полипептид подвергался очистке с помощью ОФ-ВЭЖХ (рис. 7, Б). Совпадение молекулярных масс, инсектицидной активности и хроматографической подвижности рекомбинантного и на-тивного токсинов свидетельствовало в пользу их идентичности Выход составил 0,5 мг/л культуры.
Были получены укороченные производные токсина OtTx 1a, соответствующие его отдельным доменам. Не только линкерная последовательность напоминает PQM, но также можно заметить и мутировавшую версию инвертированного мотива PQM (iPQM), который также является сайтом процессинга в сложных предшественниках токсинов [90]. Вероятно, что в нашем случае произошла замена остатка аргинина, необходимого для расщепления предшественника, на глутамин в положении 42. Основываясь на этом, была выведена последовательность, соответствующая «немутировавшей процессированной» версии N-концевого домена OtTx 1a (остатки 1 – 41). Поскольку с большой долей вероятности пептид, соответствующий N-концевому фрагменту OtTx 1a, обладает антимикробной активностью, он был назван OtTx 1a-AMP. OtTx 1a-AMP был синтезирован методами классического химического синтеза в лаборатории протеомики ИБХ РАН.
В связи с тем, что в первичной структуре С-концевого домена (остатки 50 – 108) был обнаружен характерный мотив цистинового узла, его назвали OtTx 1a-ICK. Способ получения OtTx 1a-ICK аналогичен тому, как это было описано выше для OtTx 1a. OtTx 1a-ICK получали с помощью генной инженерии в системе E.coli в виде химерного белка с тиоредоксином (Trx-OtTx 1a-ICK). В составе этого белка также была последовательность из 6 остатков гистидина для его выделения из клеточного лизата методом аффинной хроматографии. Для расщепления Trx-OtTx 1a-ICK с помощью BrCN между аминокислотными последовательностями тиоредоксина и целевого пептида был введен остаток метионина. Рисунок 8 Три стадии рефолдинга OtTx 1a-ICK. Профиль ОФ-ВЭЖХ после (А) 1 суток, (Б) 2 суток, (В) 5 суток инкубации. Стрелками обозначены разные конформации целевого пептида. Были проверены разные условия получения Trx-OtTx 1a-ICK: варьировались экс-прессионные штаммы E.coli, температура и продолжительность инкубации, концентрация индуктора ИПТГ. В результате, в связи с тем, что пептид обладает 5 дисульфидными связями, оптимальным оказался штамм Origami B. Экспрессию проводили при +22 С в течение ночи. Уровень продукции химерного белка Trx-OtTx-ICK был высоким (выход 100 мг/л). После расщепления гибридного белка на хроматографическом профиле несколько пиков по молекулярной массе их компонентов соответствовали OtTx 1a-ICK, что говорит об образовании нескольких конформаций пептида в результате некорректного замыкания дисульфидных связей. Эксперименты по окислению тиольных групп OtTx 1a-ICK после расщепления гибридного белка не увенчались успехом, поэтому для получения пептида в правильной конформации процедуре рефолдинга подвергали гибридный белок. Для контроля за ходом реакции отбирали пробы через 1, 2 и 5 суток, проводили расщепление BrCN и анализировали методом ОФ-ВЭЖХ. О правильном замыкании дисульфидных мостиков судили по форме хроматографического профиля. На рис. 8 видно, что в течение нескольких суток происходит постепенное уменьшение количества пиков, соответствующих разным конформациям OtTx 1a-ICK, и к пятым суткам остается только один пик. Молекулярная масса полученного таким образом OtTx 1a-ICK точно соответствовала расчетной массе с учетом того, что дисульфидные мостики замкнуты. Выход продукта составил 5 мг/л культуры, что значительно превышает выход полноразмерного рекомбинантного токсина, поскольку данный полипептид лишен домена с цитолитической активностью.
Алгоритмы предсказания вторичной структуры выделяют два домена в составе OtTx 1a. N-концевой фрагмент, состоящий из 45 аминокислотных остатков, склонен к формированию -спирали, в то время как для C-концевого фрагмента характерна высокая склонность к формированию -поворотов. Линкерная область (остатки 46 – 55), скорее всего, не упорядочена.
Расчеты, полученные методами биоинформатики, подтверждаются при измерении спектров кругового дихроизма (рис. 9). Расчет долей разных типов вторичной структуры в различных растворителях для полноразмерного OtTx 1a, а также для его укороченных производных приведен в табл. 5.
Обзор литературы 7
1. Введение 7
2. Состав яда пауков 7
2.1 Белковые компоненты яда 8
2.2 Пептидные компоненты яда 9
2.2.1 Однодоменные токсины 9
2.2.2 Двудоменные токсины 16
3. Организация белков-предшественников токсинов 21
4. Гены токсинов животных 23
4.1 Гены токсинов пауков 23
4.1.1 Гены пептидных токсинов 23
4.1.2 Гены белковых токсинов 24
4.2 Гены токсинов скорпионов 24
4.3 Гены токсинов моллюсков конусов 27
4.4 Гены токсинов змей 30
5. Эволюция токсинов белковой/пептидной природы 33
5.1 Откуда берутся токсины? 33
5.2 Молекулярные механизмы эволюции токсинов 35
5.2.1 Конусы 36
5.2.2 Змеи 37
5.2.3 Скорпионы 42
5.2.4 Пауки 44
5.2.5 Морские анемоны 46
5.3 Заключение 47
Материалы и методы 49
1. Материалы 49
1.1 Неорганические вещества 49
1.2 Органические вещества 49
1.3 Реактивы для молекулярной биологии: 49
1.4 Клеточные линии 49
1.5 Питательные среды и их составляющие 49
2. Методы 50
2.1 Получение двудоменных токсинов и их производных 50
2.1.1 Выделение двудоменных токсинов из цельных ядов 50
2.1.2 Химический синтез пептидов 51
2.1.3 Получение рекомбинантных пептидов 51
2.2 Аналитические методы 53
2.2.1 Определение первичной структуры пептидов 53
2.2.2 Исследование вторичной структуры пептидов методом кругового дихроизма 53
2.2.3 Определение концентрации пептидов 54
2.2.4 Масс-спектрометрия 54
2.2.5 Методы биоинформатики 54
2.3 Изучение функциональной активности пептидов 54
2.3.1 Взаимодействие с искусственными мембранами 54
2.3.2 Биологическая активность 55
2.4 Работа с кДНК и геномной ДНК 56
2.4.1 Библиотеки кДНК из ядовитых желез 56
2.4.2 Выделение ДНК и РНК из ядовитых желез пауков 57
2.4.3 Амплификация кДНК и фрагментов геномной ДНК и секвенирование 57
2.4.4 Анализ нуклеотидных последовательностей 58
Результаты 60
1. Токсины пауков рода Oxyopes 60
1.1 Выделение двудоменных токсинов 60
1.2 Определение последовательности OtTx 61
1.3 Анализ последовательности OtTx 61
1.4 Структура белка-предшественника OtTx 64
1.5 Получение полноразмерного OtTx 1a и его фрагментов 64
1.5.1 Получение OtTx 1a 64
1.5.2 Получение OtTx 1a-AMP 65
1.5.3 Получение OtTx 1a-ICK 65
1.6 Вторичная структура OtTx 1a 67
1.7 Биологическая активность OtTx 1a и его производных 68
2. Гены двудоменных токсинов пауков рода Oxyopes 69
2.1 Анализ последовательностей кДНК из ядовитых желез пауков Oxyopes 69
2.2 Структура генов спайдеринов 71
2.3 Молекулярная эволюция двудоменных токсинов Oxyopes 72
3. Выделение новых двудоменных токсинов из яда паука C. punctorium 75
4. Гены двудоменных токсинов C. punctorium 76
4.1 Анализ последовательностей кДНК из ядовитых желез паука C. punctorium 76
4.2 Структура генов CpTx-подобных токсинов 78
4.3 Молекулярная эволюция двудоменных токсинов C. punctorium 78
5. Двудоменные токсины паука L. tarabaevi 81
Обсуждение 84
1. Получение рекомбинантных полипептидов 84
2. OtTx-подобные токсины Oxyopes – новый класс двудоменных токсинов 86
2.1 Двудоменная структура токсинов OtTx 86
2.2 N-концевой модуль OtTx 1a – мощный цитолитический токсин 87
3. Синергизм в основе активности цитоинсектотоксинов L. tarabaevi 87
4. Разнообразие двудоменных токсинов 88
4.1 Двудоменные токсины Oxyopes 89
4.2 Двудоменные токсины C. punctorium 90
5. Безинтронные гены двудоменных токсинов 90
6. Молекулярная эволюция двудоменных токсинов 92
6.1 Анализ типов отбора, действующего на двудоменные токсины 92
6.2 Возникновение токсинов типа AMP+ICK у Oxyopes 93
6.3 Возникновение токсинов типа ICK+ICK у Cheiracanthium 94
Выводы 97
Список литературы 98
