Введение
2. Литературный обзор
Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования 8
2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий 8
2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных бактерий 9
2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов 9
2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий 10
2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий 11
2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков 11
2.3.2. Пространственная организация молекул поринов 15
2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры -баррельных белков 19
2.4. Способы получения изолированных поринов 22
2.5. Конформационные переходы изолированных поринов 24
2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий 28
2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами 28
2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант 30
2.7. Регуляция экспрессии OmpF и OmpC поринов грамотрицательных Бактерий 32
2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri 34
3. Обсуждение результатов 39
3.1. Получение неспецифических (OmpF- и OmpC- подобных) поринов наружной мембраны Y. ruckeri 40
3.1.1. Первичная структура OmpC– и OmpF поринов из Y. ruckeri 40
3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы 40
3.1.2.1. Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом 41
3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции пориновых белков 42
3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и OmpC-подобных поринов и их идентификация 44
3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 47
3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина Y. ruckeri 47
3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и OmpC поринов 49
3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и OmpC поринов из НМ Y. ruckeri 49
3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri 50
3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и OmpC
поринов Y. ruckeri 52
3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры 52
3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 56
3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 59
3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri под действием температуры 66
3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и OmpC поринов в процессе термоденатурации 66
3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры 69
3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика OmpF порина Y. ruckeri 76
3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина Y. ruckeri 76
3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri 78
3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из
НМ Y. pseudotuberculosis 78
3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri 80
3.6. Взаимодействие OmpF порина Y. ruckeri с клетками эукариот
4. Экспериментальная часть 87
4.1. Материалы 87
4.2. Приборы и оборудование 87
4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов 87
4.4. ПЦР амплификация и секвенирование ompC и ompF генов 88
4.5. Получение изолированных поринов иерсиний 88
4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов 89
4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью техники БЛМ 90
4.8. Построение теоретических моделей поринов 91
4.9. Иммунохимические методы 91
4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот 92
5. Выводы 94
Список сокращений 95
Список литературы .
