Введение
1. Обзор литературы. Посттрансляционные модификации рибосомных белков Escherichia coli 8
Введение 8
1.1. Процессинг N-конца рибосомных белков 10
1.2. Процессинг С-конца белка L31 12
1.3. Метилирование рибосомных белков 14
1.3.1. Метилирование белка L11 15
1.3.2. Метилирование белка L3 19
1.3.3. Метилирование белка S11 и образование изомерной пептидной связи 22
1.3.4. Метилирование белка L7/L12 24
1.3.5. Метилирование белков L16 и L33 25
1.4. Ацетилирование рибосомных белков 26
1.4.1. Ацетилирование белка S5 27
1.4.2. Ацетилирование белка S18 29
1.4.3. Ацетилирование белка L12 32
1.5. Гидроксилирование белка L16 34
1.6. Метилтиолирование белка S12 36
1.7. Олигоглутамилирование белка S6 42
Заключение 47
2. Обсуждение результатов 48
Введение 48
2.1. Зависимость модификации белка S6 от стадии роста бактериальной культуры 51
2.2. Определение субстратной специфичности фермента RimK 53
2.3. Влияние олигоглутамилирования белка S6 на процесс трансляции 55
2.4. Влияние модификации белка S6 на активность рибосом in vitro 60
2.5. Влияние модификации белка S6 на выживаемость бактериальной культуры в условиях дефицита ресурсов 66
2.6. Связь модификации белка S6 c образованием спящих бактериальных клеток 69
Заключение 78
3. Материалы и методы 81
3.1. Реактивы и биопрепараты 81
3.1.1. Реактивы 81
3.1.2. Буферы и растворы 81
3.1.3. Штаммы и плазмиды 84
3.1.4. Олигонуклеотиды 85
3.2. Методики, использованные в работе 86
3.2.1. Манипуляции с ДНК 86
3.2.1.1. Выделение плазмидной ДНК 86
3.2.1.2. Определение концентрации ДНК в растворе.. 86
3.2.1.3. Рестриктный анализ плазмидной ДНК 86
3.2.1.4 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 87
3.2.1.5.. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 87
3.2.1.6. Приготовление вектора и вставки 87
3.2.1.7. Лигирование 87
3.2.1.8. ПЦР.. 88
3.2.1.9. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagene) 88
3.2.1.10. Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктов 89
3.2.1.11. Приготовление компетентных клеток 89
3.2.1.12. Трансформация компетентных клеток 89
3.2.2. Получение модельных штаммов rimK-S6-cat и rimK-S6-E4-cat 90
3.2.2.1. Получение кассеты для трансформации 90
3.2.2.2. Внесение кассеты в геномную ДНК 90
3.2.2.1. Анализ полученных клонов 91
3.2.3. Получение плазмиды для экспрессии гена rimK 91
3.2.4. Работа с клеточными культурами 92
3.2.4.1. Определение титра клеток 92
3.2.4.2. Измерение выживаемости клеток в стационарной фазе роста 92
3.2.4.3. Измерение скорости вытеснения клеток rimK клетками дикого типа при совместном культивировании 92
3.2.4.4. Определение количества спящих клеток (ампициллиновый тест) 92
3.2.4.5. Определение количества спящих клеток c помощью проточной цитометрии 93
3.2.5. Выделение рибосом, белков, клеточных экстрактов 93
3.2.5.1. Выделение фракции рибосом 93
3.2.5.2. Выделение суммарного рибосомного белка 94
3.2.5.3. Белковый электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 94
3.2.5.4. Иммуноблоттинг 94
3.2.5.5. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез 95
3.2.5.6. Окрашивание белковых ПААГ серебром 96
3.2.5.7. Идентификация белковых зон в ПААГ 96
3.2.5.8. Мечение флуоресцентной меткой вновь синтезированных белков. 96
3.2.5.9. Выделение рекомбинантного фермента RimK с помощью Ni-NTA агарозы 97
3.2.5.10. Приготовление клеточного экстракта S30 97
3.2.5.11. In vitro трансляция 98
3.2.5.12. Проведение модификации белка S6 in vitro 98
4. Выводы 99
Список литературы
