Введение
Литературный обзор 13
1. Биофармацевтическая промышленность: базис и надсройка 13
2. Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках 2.1. Образование тел включения 23
2.2. Ренатурация и рефолдинг 3. Особенности биосинтеза рекомбинантных белков в клетках млекопитающих 52
4. Выделение и очистка генно-инженерных белков 4.1. Очистка белков от бактериальных эндотоксинов 68
4.2. Очистка от фрагментов нуклеиновых кислот 79
4.3. Очистка от вирусов 80
4.4. Очистка от родственных белков 81
4.5. Валидация процессов выделения и очистки 83
5. Примеры выделения и очистки значимых биофармацевтических белков .86
5.1. Производные инсулина 87
5.1.1. Стадии технологического процесса 89
5.1.2. Технология получения рекомбинантного инсулина гларгина 90 5.2. Интерферон-гамма 92
5.2.1. Процесс «upstream» 93
5.2.2. Этапы “downstream" процесса 94
5.3. Фоллитропин 95
5.3.1. Вектор экспрессии рекомбинантного фоллитропина 96
5.3.2. Очистка рекомбинантного ФСГ 97
Результаты и обсуждение 102
1. Создание промышленной технологии выделения и очистки человеческого
инсулина в производстве препарата-биодженерика 103
1.1. Разработка внутрипроизводственного контроля содержания мономера РП в растворах 104
1.2. Растворение ТВ и денатурация РП . 115
1.3. Рефолдинг РП. 117
1.4. Валидация внутрипроизводственного контроля чистоты мономера РП в растворах методом ПААГЭ. 119
1.5. Очистка РП. 131
1.6. Ферментативный гидролиз РП. 133
1.7. Очистка ГИЧ и получение АФС. 136
2. Создание промышленной технологии выделения и очистки инсулина-глар гина в производстве препарата-биодженерика. 141
2.1. Растворение ТВ и денатурация РП. 142
2.2. Рефолдинг РП. 144
2.3. Очистка РП. 152
2.4. Создание метода внутрипроизводственного контроля ИГ. 155
2.5. Ферментативный гидролиз РП. 156
2.6. Очистка ИГ и получение АФС 159
2.7. Подтверждение эквивалентности. 164
3. Создание промышленной технологии выделения и очистки N,N-бисметио нилгистона Н1.3 в производстве оригинального препарата «Онкохист» 168
3.1. Валидация методов внутрипроизводственного контроля. 172
3.2. Выделение БМГ из клеток . 180
3.3. Предочистка и концентрирование БМГ. 182
3.4. Основная очистка БМГ и получение АФС. 187
4. Создание промышленной технологии выделения и очистки интерферона гамма в производстве препарата-биодженерика . 205
4.1. Выделение из клеток ТВ, денатурация Инт-Г. 205
4.2. Ренатурация Инт-Г. 208
4.3. Очистка Инт-Г и получение АФС. 210
5. Создание промышленной технологии выделения и очистки фолликулости мулирующего гормона в производстве препарата-биодженерика . 215
5.1. Контроль метаболизма клеточной линии 218
5.2. Внешняя перфузия белковой фракции из культуральной жидкости .221
5.3. Вирусная инактивация и предочистка ФСГ 224
5.4. Основная очистка ФСГ методами аффинной и гидрофобной хроматографии. 228
5.5. Финишная очистка и получение АФС. 231
5.6. Подтверждение эквивалентности. 234
6. Алгоритм разработки технологий выделения и очистки генно-инженерных
белков 236
Материалы, приборы и методы 240
1. Материалы 240
1.1. Реактивы 240
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны 241
2. Приборы 243
2.1. Хроматографические системы 243
2.2. Оборудование 244 3. Методы 244
3.1. Контроль производства ГИЧ методом ВЭЖХ 244
3.2. Контроль производства ИГ методом UPLC 245
3.3. Контроль ГИЧ, ИГ, БМГ и Инт-Г методом SEC 246
3.4. Контроль производства БМГ методом ОФ ВЭЖХ 247
3.5. SDS-PAGE 249
3.6. Контроль лактатов методом ВЭЖХ 249
3.7. Масс-спектрометрия ИГ 249
3.8. Пептидное картирование ИГ 249
3.9. Получение ГИЧ 2 3.10. Получение ИГ 254
3.11. Получение БМГ 258
3.12. Получение Инт-Г 260
3.13. Получение ФСГ 262
Выводы 265
Список опубликованных работ 267
Благодарности 275
Библиография
