Введение
Глава 1. Обзор литературы. 11
Формирование представлений о мутационном процессе 11
1.1. Первые гипотезы о причинах мутационных изменений 11
1.2. Вклад физиологической теории мутационного процесса М. Е. Лобашева в формирование современных представлений о мутационных изменениях генетического материала 13
1.3. Современные представления о мутационном процессе 15
1.4. Методы выявления первичных повреждений ДНК
1.5. Методы генетической токсикологии для выявления мутаций и хромосомных аберраций 23
1.6. Альфа-тест как метод для выявления фенотипического проявления первичных повреждений и наследуемых изменений генетического материала 26
1.6.1. Генетические механизмы, лежащие в основе альфа-теста 27
1.6.1.1. Жизненный и клеточный циклы гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 27
1.6.1.2. Генетический контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 30
1.6.1.3. Переключение типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 31
1.6.2. Генетические события, учитываемые в альфа-тесте 34
1.6. Постановка задачи 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе 43
2.2. Плазмиды 44
2.3. Среды и условия культивирования 45
2.4. Реактивы 46
2.5. Стандартные методы генетики дрожжей 46
2.6. Молекулярно-генетические методы 46
2.7. Обработка клеток эталонными мутагенами 47
2.8. Фотореактивация 47
2.9. Тесты на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию 2.10. Определение общей частоты "незаконной" гибридизации и цитодукции. 48
2.11. Определение типа спаривания "незаконных" гибридов и цитодуктантов 49
2.12. Количественный тест на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину 50
2.13. Процедура синхронизации дрожжевых клеток перед проведением проточной
цитометрии 50
2.14. Подготовка образцов для проточной цитометрии 51
2.15. Микроскопия с флуоресцентной окраской DAPI (4 ,6-диамидино-2-фенилиндол) 51
2.16. Статистические методы 52
Глава 3. Результаты 54
3.1. Исследование фенотипического проявления модификаций оснований ДНК, индуцированных аналогами оснований, в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 54
3.1.1. Влияние 6-N-гидроксиламинопурина на частоту наследуемых и ненаследуемых повреждений ДНК 54
3.1.2. Влияние накопления эндогенного 8-окcогуанина на частоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала 60
3.2. Влияние инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями на частоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала, выявляемых в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 63
3.3. Изучение способности пиримидиновых димеров проявляться фенотипически в альфа-тесте 67
3.4. Исследование фенотипического проявления двунитевых разрывов ДНК в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 71
3.5. Изучение природы "незаконных" гибридов, потерявших хромосому III 76
3.6. Изучение фенотипического проявления первичных повреждений генетического материала в клеточном цикле 79
3.6.1. Подбор условий для синхронизации дрожжевых штаммов, используемых в альфа-тесте 79
3.6.2. Тест на "незаконную" гибридизацию с использованием синхронизированных на стадии G1 дрожжевых культур 86
3.6.3. Тест на "незаконную" цитодукцию с использованием дрожжевых культур, заблокированных на стадии G1 90
Глава 4. Обсуждение 95
4.1. Молекулярная природа первичных повреждений, способных проявляться фенотипически 95
4.2. Особенности устранения различных типов первичных повреждений в ходе клеточного цикла 96
4.3. Преимущества и ограничения альфа-теста 105
Заключение 107
Выводы 108
Список литературы
