Введение
1.Обзор литературы 12
1.1 Репрограммирование и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки 12
1.1.1. Понятие репрограммирования, методы репрограммирования. 12
1.1.1.1. Генетическое репрограммирование. Гены, участвующие в репрограммировании 14
1.1.2. Интеграционные и неинтеграционные методы генетического репрограммирования 15
1.1.3. Характерные особенности ИПСК 19
1.1.3.1. Морфологические характеристики ИПСК человека 19
1.1.3.2. Молекулярные характеристики ИПСК 20
1.1.3.3. Сходство ИПСК и ЭСК человека по паттернам экспрессии генов и метилирования ДНК 21
1.1.3.4. Метилирование ДНК в процессе репрограммирования 22
1.1.3.5. Плюрипотентность ИПСК 26
1.1.4. Направленная дифференцировка ИПСК в нейроны 27
1.2 Болезнь Паркинсона 31
1.2.1. Патогенез болезни Паркинсона на клеточном уровне 33
1.2.2. Причины развития БП
1.2.2.1. Внешние факторы, вызывающие БП 35
1.2.2.2. Наследственные факторы, вызывающие развитие БП
1.2.2.2.1. SNCA (PARK1/4) 37
1.2.2.2.2. PINK1 (PARK6) 37
1.2.2.2.3. DJ-1 (PARK7) 38
1.2.2.2.4. LRRK2 (PARK8) 39
1.2.2.2.5. PRKN (PARK2) 40
1.2.3. Модели БП на основе ИПСК 41
2.Материалы и методы 45
2.1 Реагенты и материалы исследования 45
2.1.1. Базовые среды и добавки к ним 45
2.1.2. Рекомбинантные белки и низкомолекулярные соединения 45
2.1.3. Другие реактивы для работы с культурами клеток 46
2.1.4. Реактивы для молекулярной биологии 46
2.1.5. Расходные материалы 47
2.1.6. Составы сред для культивирования клеток 47
2.2. Протоколы экспериментов 48
2.2.1. Информация о донорах биологического материала 48
2.2.2. Получение первичных культур фибробластов кожи пациентов 48
2.2.3. Получение лентивирусов 49
2.2.4. Получение ИПСК с помощью лентивирусных векторов 50
2.2.5. Получение ИПСК человека с помощью генетических конструкций на основе вируса Сендай 51
2.2.6. Культивирование ЭСК и ИПСК человека 52
2.2.7. Определение мутаций в линиях ИПСК 53
2.2.8. Измерение пролиферативной активности ИПСК человека 54
2.2.9. Иммуноцитохимический анализ
2.2.10. Полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией 55
2.2.11. Приготовление препаратов метафазных хромосом ИПСК человека 56
2.2.12. GTG-Дифференциальное окрашивание 57
2.2.13. Формирование и культивирование эмбриоидных телец 57
2.2.14. Спонтанная дифференцировка ИПСК человека 57
2.2.15. Дифференцировка ИПСК в дофаминергические нейроны 58
2.2.16. Проточная цитофлуориметрия
2.2.16.1. Окрашивание поверхностных маркеров 58
2.2.16.2. Окрашивание цитоплазматических маркеров и окрашивание для анализа клеточного цикла 59
2.2.17. Измерение выработки дофамина нейронами 60
2.2.18. Полногеномный анализ метилирования ДНК 60
2.2.19. Полногеномный транскриптомный анализ 61
3.Результаты и их обсуждение 62
3.1. Получение, характеристика и сравнительный анализ эффективности репрограммирования фибробластов кожи человека интеграционным и неинтеграционным методами 62
3.2. Изучение влияния интеграционного и неинтеграционного методов репрограммирования на метилирование ДНК в ИПСК человека 76
3.3. Сравнительное исследование условий культивирования фибробластов и ИПСК, полученных от здорового донора и пациентов с БП 79
3.4. Разработка эффективного и воспроизводимого протокола дифференцировки ИПСК в тирозингидроксилаза-положительные нейроны 3.5. Изучение эффективности дифференцировки нормальных ИПСК и ИПСК, полученных от доноров с БП 89
3.6. Изучение дифференциальной экспрессии генов в нейрональных производных ИПСК, полученных от пациентов с БП и здорового донора 96
Заключение 104
Выводы 106
Список использованных сокращений 107
Список публикаций по теме диссертации 109
