Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Бобово-ризобиальный симбиоз 15
1.2Ростостимулирующие ризобактерии (PGPR) и возможности их применения
1.2.1. Ризобии как PGPR 17
1.2.2. Механизмы стимуляции роста растений ризобиями 19
1.3. Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
1.3.1. Бактериальная аутоагглютинация 24
1.3.2. Биопленки 26
1.3.3. Полисахариды клеточной стенки ризобий 28
1.3.4. Бактериальные адгезины
1.4. Ризобиальный адгезин RapA1 33
1.5. Способы улучшения колонизации корней растений ризобиями 36
1.6. Бинарные биоудобрения на основе ризобактерий 40
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 44
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при 46 проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.3. Реактивы и материалы 46
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов и 48 сред
2.5. Методы исследований 50
2.5.1. Выделение и очистка ДНК бактерий 50
2.5.2. ПЦР 51
2.5.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК 51
2.5.4. Препаративный гель-электрофорез ДНК 53
2.5.5. Выделение белков из клеток растений и бактерий 53
2.5.6. Вестерн-блот анализ 54
2.5.7. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4
2.5.8. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 57
2.5.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5.10. Подготовка компетентных клеток E. coli 60
2.5.11. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной 60 ДНК
2.5.12. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным 61 методом
2.5.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 62
2.5.14. Приготовление электрокомпетентных клеток ризобактерий 62
2.5.15. Электропорация компетентных клеток ризобактерий 62
2.5.16. Определение ростовых параметров растений 63
2.5.17. Определение нитрогеназной активности бактерий 64
2.5.18. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий 65
2.5.19. Бинарное сокультивирование бактерий и микроскопирование
2.5.20. Агробактериальная трансформация листовых пластинок растений табака
2.5.21. Анализ -глюкуронидазной (gus) активности 67
2.5.22. Выделение и очистка ДНК растений 68
2.5.23. Выделение и очистка РНК растений 68
2.5.24. Синтез кДНК 69
2.5.25. Иммунофлуоресцентный анализ для определения локализации белка RapA
2.5.26. Обработка корней табака R. leguminosarum и подсчет количества адсорбированных на поверхности корней бактерий
2.5.27. Статистический анализ 71
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Поиск и выделение гена rapA1 из штаммов R. leguminosarum 73
3.2. Создание генно-инженерной конструкции на основе вектора pJN для конститутивной экспрессии гена rapA1 в бактериях
3.3. Получение и анализ рекомбинантных по гену rapA1 бактерий 76
3.3.1. Вестерн-блот белка RapA1 в трансформированных бактериях 76
3.4. Агглютинация бактерий, рекомбинантных по гену rapA1, в бинарной системе сокультивирования
3.5. Оценка влияния рекомбинантных штаммов ризобий на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры на растения фасоли
3.6. Бинарная инокуляция растений фасоли и козлятника рекомбинантными и нетрансформированными штаммами
3.6.1. Совместная обработка рекомбинантными и нетрансформированными штаммами ризобий растений фасоли и козлятника
3.6.2. Идентификация гена rapA1 у бактерий, выделенных из клубеньков обработанных растений
3.7. Получение и анализ трансгенных по гену rapA1 растений табака
3.7.1. Создание векторной конструкции pCambia 1301 несущей ген адгезина rapA1 с лидерным пептидом секретируемого лектина гороха PSL
3.7.2. Получение растений табака, экспрессирующих ген rapA1 99
3.7.3. Вестерн-блот анализ белков, выделенных из трансгенных 102 растений табака 3.7.4. Иммунофлуоресцентный анализ локализации белка RapA1 на 103 корнях трансгенных растений табака
3.7.5. Адгезия бактерий на корнях трансгенных растений табака 104
Заключение 108
Выводы 111
Список литературы
