Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Характеристика рода Agrobacterium 14
1.2 Ri-плазмидa 15
1.3 Морфологические эффекты и функции rol-генов 17
1.3.1 Характеристика гена rolA 17
1.3.2 Характеристика гена rolВ 19
1.3.3 Характеристика гена rolС 22
1.3.4 Характеристика гена rolD 24
1.4 Стадии интеграции Т-ДНК и последующая экспрессия генов в бородатых корнях 25
1.5 Происхождение rol-генов 29
1.6 Эволюция rol-генов 30
1.7 Прикладное значение rol-генов 33
1.7.1 Применение hairy roots в биотехнологической промышленности 33
1.7.2 Применение культур бородатых корней в фармацевтической промышленности 37
1.7.3 Применение rol-генов в агропромышленности 39
1.8 Методы получения культуры hairy roots 42
Глава 2 Материалы и методы исследования 49
2.1 Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 49
2.2 Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР 50
2.3 Методы исследований 52
2.3.1 Выделение тотальной ДНК из агробактерий 52
2.3.2 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 53
2.3.3 Быстрое выделение тотальной ДНК бактерий при помощи 0.5%ного тритона Х-100 для ПЦР-анализа 54
2.3.4 Выделение РНК и построение первой цепи кДНК 54
2.3.5 Полимеразная цепная реакция 56
2.3.6 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 57
2.3.7 Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 58
2.3.8 Приготовление химически компетентных клеток E. coli 58
2.3.9 Химическая трансформация компетентных клеток E. coli 59
2.3.10 Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом 60
2.3.11 Приготовление питательных сред для растений 60
2.3.12 Выделение и очистка тотальной ДНК из растений 62
2.3.13 Стерилизация семян и листьев растений 64
2.3.14 Выделение изолированных зародышей и индукция каллусов у мягкой пшеницы 64
2.3.15 Получение ауксин-индуцированных адвентивных корней табака 65
2.3.16 Индукция hairy roots методом сокультивирования с A. rhizogenes 65
2.3.17 Генетическая трансформация с использованием игольчатых кристаллов карбида кремния 67
2.3.18 Восходящая тонкослойная хроматография 67
2.3.19 Выделение гексановой экстракции из корней одуванчиков в лабораторных условиях 68
2.3.20 Биобаллистическая трансформация 68
2.3.21 Измерение сырой массы и оценка скорости роста корневых культур 71
2.3.22 Статистическая обработка полученных результатов 72
Глава 3 Результаты и обсуждение 73
3.1 Классическая агробактериальная трансформация 73
3.1.1 Получение культуры бородатых корней табака на различных типах эксплантов 73
3.1.2 Получение регенерантов из культуры hairy roots табака 75
3.2 Агробактериальная трансформация Withania somnifera 79
3.3 Агробактериальная трансформация Parasponia andersonii 83
3.4 Агробактериальная трансформация Taraxacum kok-saghyz и Taraxacum hybernum 87
3.5 Изучение последовательностей нуклеотидов Т-ДНК штаммов A. rhizogenes, подбор соответствующих праймеров и амплификация rol генов 93
3.6 Биобаллистическая трансформация листовых эксплантов табака с помощью ампликона, содержащего rol-гены 96
3.7 Сравнительный морфологический и ОТ-ПЦР анализ изолированно растущих адвентивных корней табака, полученных разными методами 100
3.7.1 Получение ауксин-индуцированных адвентивных корней 100
3.7.2 Анализ параметров роста культур корней, полученных различными методами на жидкой и твердой питательной среде 102
3.7.3 ОТ-ПЦР анализ изолированно растущих адвентивных корней табака, полученных разными методами 105
3.7.4 Обсуждение результатов сравнительного морфологического и молекулярного анализа корней 108
3.8 Биобаллистическая трансформация каллусов мягкой пшеницы 111
Заключение 118
Выводы 121
Список литературы 122
