Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Организация апикальной меристемы побега наземных (высших) растений 12
1.1.1 Структурные модели апикальной меристемы побега (АМП) 12
1.1.2. Структурно-функциональные модели апикальной меристемы побега, основанные на данных молекулярно-генетических исследований 18
1.1.3. Симпластическая структура апикальной меристемы побега и неклеточноавтономная регуляция функций меристемы 21
1.1.4 Некоторые функциональные аспекты плазмодесм семенных и несеменных растений 25
1.2. Гипотезы о происхождении листьев сосудистых растений. 27
1.2.1. Особенности заложения макрофилльных и микрофилльных листьев. 28
1.2.2. Программы развития макрофилльных и микрофилльных листьев отражают их эволюционное происхождение. 29
1.3. KNOTTED1–подобные гомеобокс-гены, их функции в апикальной меристеме побега 31
1.3.1. Молекулярная характеристика представителей семейства транскрипционных факторов KNOTTED1 31
1.3.2. Филогения транскрипционных факторов семейства KNOX 33
1.3.3. Анализ характера экспрессии генов семейства KNOTTED1 у представителей различных таксонов сосудистых растений с разными типами АМП 36
1.3.3.1. Клеточно-тканевая локализация экспрессии KNOX генов I класса у покрытосеменных растений с дуплексной АМП. 36
1.3.3.2. Клеточно-тканевая локализация экспрессии KNOX генов I класса у голосеменных растений с дуплексной и симплексной АМП. 45
1.3.3.3. Клеточно-тканевая локализация экспрессии KNOX генов I класса у несеменных растений с моноплексной АМП. 46
1.4. Семейство транскрипционных факторов YABBY, их роль в развитии листа и взаимодействие с белками KNOX 54
1.4.1. Молекулярная характеристика представителей семейства транскрипционных факторов YABBY. 54
1.4.2. Эволюция генов YABBY 55
1.4.3. Анализ клеточно-тканевых доменов экспрессии генов семейства YABBY у представителей различных таксонов растений. Функции генов YABBY . 57
1.5. Группа транскрипционных факторов ARP семейства MYB, их роль в развитии листа. 66
1.5.1. Функции генов ARP. Анализ экспрессии генов ARP у представителей различных таксонов сосудистых растений 66
2. Материал и методы 69
2.1 Морфологическая характеристика растительного материала 69
2.1.1 Huperzia selago 69
2.1.2 Selaginella kraussiana 70
2.2 Сбор растительного материала 71
2.3 Эксперимент с введением цитокинина в побеги Huperzia selago 71
2.4 Методы молекулярной биологии 72
2.4.1 Приготовление и хранение навесок меристем для выделения РНК и геномной ДНК 72
2.4.2 Выделение тотальной РНК 72
2.4.3 Очистка тотальной РНК от полисахаридов 73
2.4.4 Очистка тотальной РНК от геномной ДНК 74
2.4.5 Синтез кДНК 74
2.4.6 Выделение геномной ДНК Huperzia selago 74
2.4.7 Определение концентрации нуклеиновых кислот 76
2.4.8 Полимеразная цепная реакция 76
2.4.9 ПЦР с колониями бактерий 79
2.4.10 Использование агарозного геля как метода разделения и анализа фрагментов нуклеиновых кислот 79
2.4.11 Приготовление маркера -ДНК/ PstI для оценки размера и концентрации фрагментов ДНК на агарозных гелях 80
2.4.12 Экстракция фрагментов ДНК, амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции из агарозных гелей 81
2.4.13 Лигирование фрагмента ДНК в вектор 81
2.4.14 Приготовление компетентных клеток 81
2.4.15 Трансформация компетентных клеток. 82
2.4.16 Жидкие ночные культуры бактерий 83
2.4.17 Выделение плазмид из бактериальных клеток. 83
2.4.18 Препаративная рестрикция фрагментов ДНК. 83
2.4.19 Фенол-хлороформная очистка линеаризованных плазмид. 84
2.4.20 In vitro транскрипция 85
2.4.21 Щелочной гидролиз РНК-зондов. 86
2.4.22 Экстракция растворимых белков из тканей Arabidopsis thaliana, Selaginella kraussiana, Huperzia selago и Pisum sativum 87
2.4.23 Определение содержания белка в растительных экстрактах 88
2.4.24 SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 88
2.4.25 Вестерн-блоттинг 89
2.5 Цитологические методы работы с тканями растений 91
2.5.1 Световая микроскопия и трансмиссионная электронная микроскопия 91
2.5.2 Изготовление полутонких срезов апексов Selaginella kraussiana и Huperzia selago для детекции транскриптов генов-гомологов KNOTTED1 и YABBY методом РНК-РНК гибридизации in situ и для детекции белков-гомологов KNOTTED1 in situ методом иммуногистохимии 92
2.5.3 РНК окрашивание акридиновым оранжевым. 94
2.5.4 Силанизирование стекол. 95
2.5.5 Гибридизация РНК-РНК in situ. 95
3. Результаты 100
3.1 Характеристика строения апикальной меристемы побега Huperzia selago, ее симпластической организации и особенностей заложения листа 100
3.2 Получение РНК-содержащих срезов растительных тканей для изучения характера экспрессии целевых генов у Selaginella kraussiana и Huperzia selago 102
3.3 Исследование внутритканевой локализации транскриптов SkKNOX1 в АМП Selaginella kraussiana 103
3.3.1 Получение полного клона кодирующей последовательности SkKNOX1 Selaginella kraussiana и синтез меченых дигоксигенином РНК-зондов на основе кДНК SkKNOX1 Selaginella kraussiana методом in vitro транскрипции 103
3.3.2 Транскрипты SkKNOX1 локализуются в клетках АМП Selaginella kraussiana, как и у KNOTTED1-подобных генов цветковых растений. 108
3.4 Подбор антител к белкам KNOX несеменных растений не выявил специфичных антител. 111
3.5 Эксперименты по амплификации фрагментов кДНК генов-гомологов KNOTTED1 Huperzia selago с помощью вырожденных праймеров. 112
3.6 Выделение тотальной РНК из верхушек побегов Huperzia selago с целью дальнейшего анализа транскриптома позволило выявить гены KNOX I класса 115
3.7 Клонирование HsKNOX1-1 и HsKNOX1-2 и получение меченых дигоксигенином РНК-зондов методом in vitro транскрипции 117
3.8 Клеточный паттерн локализации транскриптов HsKNOX1-1 и HsKNOX1-2 в симплексной АМП Huperzia selago отличается от локализации транскриптов SkKNOX1 в моноплексной АМП Selaginella kraussiana 122
3.9 Поиск в полученных последовательностях транскриптома верхушек побега Huperzia selago генов-гомологов ARP и YABBY, экспрессирующихся в АМП 127
3.10 Исследование внутритканевой локализации HsYABBY в АМП Huperzia selago 129
3.10.1 Клонирование полного клона кДНК гена HsYABBY Huperzia selago. Синтез меченых дигоксигенином РНК-зондов на основе кДНК HsYABBY методом in vitro транскрипции 129
3.10.2 Внутритканевая локализация транскриптов HsYABBY в верхушках побегов Huperzia selago выявила экспрессию “листовых” генов семейства YABBY не только в детерминированных клетках примордиев листьев, но и в недетерминированных клетках АМП Huperzia selago 135
4. Обсуждение 137
4.1. Структура, симпластическая организация апикальной меристемы побега Huperzia selago, и характеристика клеточных аспектов заложения листа 137
4.2. Транскриптомныи анализ верхушек побегов равноспорового плауна Huperzia selago побега позволил впервые получить сведения о молекулярно-генетическои регуляции АМП симплексного типа несеменных растении 138
4.3. Транскрипция гомологов KNOX в АМП Huperzia selago свидетельствует о консервативном для высших растений механизме поддержания клеток в недифференцированном состоянии, но локализация транскриптов гомологов KNOX I класса HsKNOX1-1 и HsKNOX1-2 не только в АМП, но в зачатках листьев и спорангиев АМП Huperzia selago, отличается от таковой у Selaginella kraussiana 142
4.4. Для Huperzia selago впервые для несеменных растении выявлены гомологи генов YABBY, но не обнаружено гомологов генов ARP. Механизм ингибирования транскрипции KNOX при заложении листьев у разных видов плауновидных может различаться, и, возможно, связан со структурным типом АМП . 143
4.5. Экспрессия HsYABBY не только в зачатках листьев, но и в АМП принципиально отличается от таковой у покрытосеменных, у которых транскрипция YABBY никогда не происходит в АМП, но .сходна с экспрессией ARP у Selaginella kraussiana, позволяя предположить иной характер взаимодействия KNOX и их антагонистов при заложении микрофилльных листьев плауновидных. 146
4.6. Присутствие в апикальных меристемах Selaginella kraussiana и Huperzia selago единственного антагониста меристемспецифичного KNOX: ARP и YABBY, соответственно, позволяет предположить, что для регуляции образования не обладающих анатомической дорсовентральностью микрофилльных листьев достаточно одного из этих транскрипционных факторов. 147
5. Заключение 148
Выводы 150
Список литературы 151
