Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Роль протеолиза в клетке 16
1.1.1. Классификация пептидаз 16
1.1.2. Типы протеолиза белков 17
1.1.3. Пептидазы цианобактерий 27
1.1.3.1. Аминопептидазы 27
1.1.3.2. Пролиновые аминопептидазы 31
1.2. Роль N-концевых аминокислотных остатков в биогенезе белков 39
1.2.1. Правило N-концевой последовательности в клетках фотосинтезирующих эукариот 42
1.2.2. Правило N-концевой последовательности в клетках прокариот 47
1.3. Цианобактерия как модельный объект исследования 51
1.3.1. Структура цианобактериальной клетки 53
1.3.2. Светособирающий комплекс (фикобилисомы) цианобактерий 57
1.3.3. Фикобилисомы цианобактерий в условиях стресса 61
Глава 2. Объекты и методы исследования 64
2.1. Бактериальные штаммы иплазмиды 64
2.2. Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов 64
2.3. Питательная среда, лишённая азота 65
2.4. Количественный анализ пигментов 67
2.5. Биоинформационный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 68
2.5.1. Базы данных и инструменты их анализа 68
2.5.2. Построение филогенетических деревьев и компьютерное моделирование трёхмерной структуры белка РерР Synechocystis 69
2.6. Анализ нуклеиновых кислот 71
2.6.1. Выделение геномной ДНК из клеток Synechocystis 71
2.6.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. сої і щелочным методом 71
2.6.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 72
2.6.4. Очистка фрагментов ДНК из геля или реакционных смесей 72
2.6.5. Выделение тотальной РНК из Synechocystis 73
2.6.6. Электрофорез РНК в агарозном геле 74
2.6.7. Определение количества и оценка качества препаратов нуклеиновых кислот 74
2.6.8. ОТ-ПЦР 75
2.6.8.1. Обработка РНК-содержащих образцов ДНКазой 1 75
2.6.8.2. Синтез кДНК 76
2.6.8.3. Полимеразная цепная реакция 77
2.6.9. Рестрикция ДНК 78
2.6.10. Секвенирование ДНК 79
2.7. Клонирование фрагментов ДНК в плазмидные вектора 79
2.7.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli кальциевым методом 80
2.7.2. Трансформация Е. coli 81
2.8. Трансформация клеток Synechocystis 81
2.9. Световая микроскопия в проходящем свете 82
2.10. Трансмиссионная электронная микроскопия 82
2.11. Выделение белков и белковых комплексов цианобактерий 83
2.11.1. Выделение фракции растворимых белков из клеток Synechocystis 83
2.11.2. Выделение тилакоидных мембран из клеток Synechocystis 83
2.11.3. Выделение фикобилисом из клеток Synechocystis 84
2.ИЛ. Количественное определение содержания белка 85
2.12. Анализ образцов белков методом электрофореза 87
2.12.1. Нативный ПААГ электрофорез 87
2.12.2. Голубой нативный ПААГ электрофорез 88
2.12.3. Двумерный (2DE) электрофорез белков 89
2.12.4. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 90
2.12.5. Окрашивание белковых гелей раствором коллоидного Кумасси-G 91
2.12.6. Негативное окрашивание белковых гелей 92
2.13. MALDIOF анализ 92
2.14. Экспрессия белка РерР Synechocystis 92
2.15. Очистка рекомбинантного белка 93
2.15.1. Удаление GST-последовательности 93
2.16. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 94
2.17. Иммунохимический анализ 94
2.18. Анализ протеолитической активности белка рерР in vitro 95
2.18.1. Гидролиз флуоресцентного субстрата 95
2.18.2. Влияние температуры ирН 96
2.18.3. Влияние ионов двухвалентных металлов 96
2.18.4. Влияние ингибиторов 96
2.18.5. Гидролиз азоказеина 97
2.19. Статистический анализ 97
Глава 3. Результаты и их обсуждение 98
3.1. Характеристика гена sll0136 с использованием биоинформационных ресурсов 98
3.2. Анализ протеолитических свойств и субстратной специфичности белка РерР 105
3.2.1. Получение чистого препарата рекомбинантного белка РерР 105
3.2.1.1. Получение экспрессионной конструкции pET-41a(+)-sll0136 105
3.2.2. Очистка рекомбинантного белка РерР 108
3.3. Анализ природы протеолитической активности белка РерР in vitro 113
3.4. Компьютерное моделирование трёхмерной структуры белка РерР 122
3.4.1. Создание моделей аминопептидазы Р 122
3.4.2. Структура доменной организации белка РерР 123
3.4.3. Взаимодействие РерР с марганцем 124
3.4.4. Взаимодействие РерР с субстратом и продуктом 126
3.4.5. Свойства поверхности и интерфейс димеризации белка РерР 127
3.5. Получение мутантного штамма АрерР Synechocystis с инактивированным геном sll0136 131
3.6. Физиологический анализ клеток мутантного штамма АрерР Synechocystis 137
3.6.1. Аминопептидаза РерР вовлечена в регуляцию скорости роста и размера клеток 137
3.6.2. В клетках, дефектных по аминопептидазе РерР, изменена структура и распределение тилакоидных мембран 145
3.6.3. Инактивация гена рерР Synechocystis привела к изменению соотношения фотосистем (ФСП/ФСІ) в тилакоидах 150
3.6.4. Аминопептидаза РерР вовлечена в регуляцию уровня белков фикобилисом у Synechocystis 153
3.6.5. У мутанта АрерР изменён профиль фракции растворимых белков 160
3.6.6. Аминопептидаза РерР не участвует в адаптации клеток Synechocystis к дефициту азота 162
3.7. Потенциальные прямые субстраты для аминопептидазы РерР 164
Заключение 166
Выводы 173
Список литературы 174
Приложение 212
