Введение
Глава I. Современные представления об особенностях сигнального обмена между бобовыми растениями и микроорганизмами при формировании cимбиотических отношений (обзор литературы) 15
1.1. Избирательность взаимодействия растений с микроорганизмами определяется способностью растений распознавать на молекулярном уровне отличительные особенности микроорганизмов 15
1.2. Сигнальный обмен между бобовыми растениями и микроорганизмами на ранних этапах формирования симбиотических отношений 18
1.2.1. Развитие азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений является результатом тонкой координации процессов в эпидерме и коре корня бобовых растений 23
1.2.2. Гены, контролирующие развитие бобово-ризобиального симбиоза 26
1.2.3. Представители семейства LysM-рецепторных киназ необходимы для контроля взаимодействия растений с симбиотическими микроорганизмами
1.2.4. Комплексы LysM-рецепторных киназ могут быть вовлечены в контроль
ответных реакций бобовых растений на действие Nod-факторов 35
1.2.5. Роль внеклеточных доменов LysM-РПК в различении структурных особенностей Nod-факторов 41
1.2.6. Математическое моделирование взаимодействия LysM-РПК c Nod-факторами 42
1.2.7. Минимальные изменения в киназном домене LysM-рецептор-подобных киназ связаны с дивергенцией сигнальных путей, ведущих к развитию симбиоза и патогенеза 46
1.3. Характеристика компонентов «общего сигнального пути» у бобовых растений, активируемого Nod-факторами 48
1.3.1. Компоненты сигнального каскада, необходимые для развития инфекции и органогенеза клубеньков 53
1.3.2. Регуляция выхода бактерий из инфекционных нитей и развития симбиосом у бобовых растений 61
1.3.3. Гены, вовлеченные в контроль органогенеза клубеньков бобовых растений 65
1.4. Участие фитогормонов ауксинов и цитокининов в контроле органогенеза клубеньков бобовых растений 68
1.4.1. Особенности регуляции транспорта ауксинов у растений 69
1.4.2. Ключевые регуляторы биосинтеза цитокининов у растений 74
1.5. В регуляцию органогенеза клубеньков у бобовых растений может быть вовлечен комплекс регуляторов пролиферации и дифференцировки клеток 76
1.5.5. Участие транскрипционных факторов KNOX и WOX семейств в процессах морфогенеза у растений 81
Заключение 83
Глава 2. Методические подходы 87
2.1.Штаммы микроорганизмов 87
2.2. Растительный материал 87
2.3. Условия выращивания растений 87
2.4. Получение растительных экстрактов 88
2.5. Вестерн-блот-анализ 88
2.6. Трансформация бактерий 88
2.7. Выделение плазмидной ДНК 89
2.8. Выделение растительной ДНК 89
2.9. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени 90
2.10. Анализ взаимодействия белков при кратковременной экспрессии влистьях Nicothiana benthamiana 91
2.11. Клонирование фрагментов ДНК для синтеза внеклеточных доменов и полноразмерных рецепторов гороха 91
2.12. Анализ связывающей способности рецепторов с Nod-факторами 92
2.13. Конструирование векторов для эктопической экспрессии генов и РНК-интерференции 92
2.14. Трансформация растений с помощью Agrobacterium rhizogenes 93
2.15. Анализ активности репортерного белка бета-глюкуронидазы в трансгенных тканях растений 94
2.16. Выделение и анализ цитокининов 95
2.17. Статистические методы и компьютерные программы 95
Глава 3. Результаты и обсуждение.
Часть 1. Изучение сигнального обмена между горохом P. sativum L. и
клубеньковыми бактериями на начальных этапах развития симбиоза 96
1.1. Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла быть связана с активацией разных сигнальных путей у гороха при рецепции Nod-факторов
1.1.1. Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a у симбиотических мутантов гороха 100
1.1.2. Анализ участия рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 в активации сигнальных путей у гороха 106
1.2. Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ гороха Sym10 и Sym37, необходимых для развития симбиоза 110
1.2.1. Синтез внеклеточных доменов рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 гороха в бактериальной системе и анализ связывающей способности с лигандом 110
1.2.1.1. Конструирование векторов, обеспечивающих внутриклеточный синтез белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в бактериях E. coli 111
1.2.1.2. Оптимизация условий наработки рекомбинантных белков-рецепторов в штамме E. coli С41 113
1.2.1.3. Очистка рекомбинантных белков Sym10-ECD и Sym37-ECD методом металлохелатной аффинной хроматографии 114 1.2.1.4. Анализ связывающей способности внеклеточных доменов Sym10 ECD и Sym37-ECD, полученных при гетерологичной экспрессии в бактериях, с Nod-факторами 117
1.2.2. Синтез полноразмерных белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в листьях N. benthamiana и анализ их связывающей способности с Nod-факторами 119
1.2.2.1. Изучение связывающей способности синтезированных в растениях полноразмерных рецепторов с Nod-факторами 122
1.3. Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам у гороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза 125
1.3.1. Компьютерное моделирование связывания LysM-РПК К1 c Nod-факторами Rh. leguminosarum bv. viciae NodRlv-IV, V, C18:4, Ac 125
1.3.2. Синтез внеклеточного домена рецептор-подобной киназы К1 в бактериях E. coli и анализ связывания с NodRlv-IV, V, C18:4, Ac 129
1.4. Фенотипический анализ мутантов по гену k1 у гороха 129
1.5.1 Анализ способности рецептор-подобных киназ гороха P. sativum L. формировать олигомерные комплексы при ко-экспрессии в листьях N. benthamiana 131
1.5.2. Изучение взаимодействия между рецепторами Sуm10, К1 и Sym37 при ко-экспрессии в листьях N. benthamiana 131
Заключение по части 1 137
Часть 2. Поиск у гороха потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации, необходимых для развития симбиоза и активации защитных систем растения 139
2.1. Поиск и изучение потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации у гороха P. sativum L. 140
2.2. Анализ участия рецепторной-киназы Lyk9 в контроле развития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы 143
2.1. Анализ влияния рецепторной-киназы Lyk9 на развитие устойчивостигороха к фитопатогенным грибам 147
2.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации с помощью биологического синтеза 149
2.4.1. Конструирование векторов, обеспечивающих синтез хитоолигосахаридов (n = 5 и 6) в бактериях E. coli 150
2.4.2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученных биосинтетическим способом 152
Заключение по части 2 154
Часть 3. Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада, активируемого Nod-факторами с фитогормонами и основными регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток при симбиозе 155
3.1. Локализация ответа на цитокинины и ауксины у растений гороха с помощью цитокинин- и ауксин-регулируемых репортерных конструкций pRR4::GUS и DR5::GFP 159
3.2. Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и B-типа), а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние (IPT и LOG), экспрессия которых возрастает при развитии симбиоза 166
3.2.1. Выявление и анализ экспрессии генов гороха, активация которых происходит при рецепции растениями фитогормонов цитокининов(регуляторов «первичного ответа» гороха на цитокинин) 166
3.2.2. Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние у гороха 167
3.2.3. Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях гороха при инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026
3.3. Идентификация генов гороха, контролирующих биосинтез (TAR) и транспорт ауксинов (PIN) 175
3.4. Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада, активируемого Nod-факторами, и регуляторами фитогормонального ответа178
3.4.1. Изучение влияния экзогенного цитокинина БАП на регуляторы цитокининового ответа и основные транскрипционные факторы сигнальногокаскада, активируемого Nod-факторами, у гороха 178
3.4.2. Сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих биосинтез/ активацию цитокининов и цитокининовый ответ у мутантов гороха 180
3.4.3. Локализация ответа на цитокинины и ауксины у мутантов SGEFix- -2, SGEFix- -5 (sym33) с помощью репортерных конструкций pRR4::GUS и DR5::GFP 184
Заключение по части 3 187
Часть 4. Изучение роли гомеодомен-содержащих транскрипционных факторов KNOX и WOX семейств в формировании клубеньков у гороха . 190
4.1 Изучение роли генов KNOX при развитии клубеньков у гороха P. sativum L. 193
4.1.1 Идентификация генов семейства KNOX, играющих существенную роль в контроле формирования клубеньков у гороха 193
4.1.2. Анализ влияния транскрипционного фактора KNOX3 на уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм цитокининов у гороха 196
4.2. Идентификация и анализ генов WOX у гороха, а также изучение их роли в процессе формирования симбиоза 200
4.2.1. Анализ экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у гороха 202
4.3. Локальный анализ экспрессии гена WOX5 при органогенезе клубеньков и изучение влияния ауксинов на экспрессию гена WOX5 204
4.4. Анализ влияния транскрипционного фактора WOX5 на регуляторы цитокининового ответа RR А-типа у гороха 206
Заключение по части 4 208
Часть 5. Изучение сигнального обмена при системном регулировании бобовыми растениями числа формирующихся клубеньков (авторегуляция симбиоза) 212
5.1. Изучение роли CLE-регуляторных пептидов в контроле органогенеза клубеньков у гороха 217
5.1.1. Идентификация CLE-пептидов у гороха, вовлеченных в систему авторегуляции симбиоза 217
5.1.2. Анализ экспрессии гена PsCLE13 у растений дикого типа и мутантов sym9 (CCaMK), sym33 (IPD3/CYCLOPS), sym7 (NSP2), sym35 (NIN),
кодирующих компоненты сигнального пути, активируемого Nod-факторами у гороха 218
5.2. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на развитие клубеньков у трансгенных растений гороха 219
5.3.1. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на
клубенькообразование гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов гороха с нарушением побеговой системы авторегуляции P88 (sym 29) и P64 (sym 28) 221
5.4. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на экспрессию генов, кодирующих рецептор Sym10 и транскрипционный фактор NIN, (компонент сигнального каскада, активируемый Nod-факторами) 223
5.5. Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системы CLAVATA при развитии клубеньков у гороха 224
5.5.1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у растений гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов 224
5.5.2. Анализ экспрессии WOX5 у супер-клубенькообразующих мутантов гороха 225
5.5.3. Анализ локализации экспрессии гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 с нарушением системы CLV 226
Заключение по части 5 229
Заключение
