Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 8
1.1 Рецепторные тирозинкиназы 8
1.2 Мини-семейство рецептора инсулина
1.2.1 Структурная характеристика рецептора инсулина, инсулиноподобного фатора роста и рецептора, подобного рецептору инсулина 11
1.2.2 IRR – сенсор внеклеточного pH 14
1.2.3 Физиологическая роль IRR 15
1.3 Сигнальные каскады рецептора инсулина, инсулиноподобного фактора роста и рецептора IRR 21
1.3.1 Семейство субстратов рецептора инсулина 21
1.3.2 Фосфатидилинозитол-(3,4,5) трифосфат и фосфоинозитид-3-киназа 25
1.3.3 Нижестоящие киназы и фосфатиды 26
1.3.4 Инсулиновый сигнальный путь, нижестоящий от фосфоинозитид 3-киназы 27
1.3.5 IRR-опосредованные сигнальные пути и клеточные эффекторы 31
1.4 Механизмы резистентности к инсулину 32
1.4.1 Липид-зависимый механизм резистентности к инсулину 33
1.4.2 Церамид-зависимый механизм резистентности к инсулину 34
1.4.3 Воспалительный процесс 35
1.4.4 Реакция несвернутого белка 36
1.4.5 Оксидативный стресс 37
ГЛАВА II Объекты и методы исследования 38
2.1 Выделение геномной ДНК из хвостов и ушей мышей 38
2.2 Генотипирование мышей с помощью ПЦР 39
2.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле 40
2.4 Извлечение органов 40
2.5 Секвенирование транскриптомов 41
2.6 Выделение РНК и синтез кДНК 41
2.7 ПЦР в реальном времени (TaqMan Realime PCR) 42
2.8 Получение плазмидных конструкций 44
2.9 Получение компетентных клеток Е. coli 45
2.10 Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК с использованием теплового шока 46
2.11 Выделение плазмидной ДНК 46
2.12 Трансфекция эукариотических клеток
2.14 Электрофорез и Вестерн-блот анализ белков 47
2.15 Поведенческие особенности мышей
2.15.1 Тестирование социального интереса мышей 48
2.15.2 Тест «резидент-интрудер» 48
2.15.3 Тест «принудительного плаванья» по Порсолту 49
2.16 Статистическая обработка данных 49
ГЛАВА III Результаты исследованИЙ 50
3.1 Получение гомозиготных мышей одного поколения (littermates) 50
3.2 Генотипирование мышей методом ПЦР 51
3.3 Результаты сравнительного анализа количества транскриптов почек мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR 54
3.4 Сравнительный анализ экспрессии генов почек методом ПЦР в реальном времени 59
3.5 Результаты сравнительного анализа количества транскриптов мозга мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR 62
3.7 Поведенческие особенности мышей, нокаутных по гену сенсора щелочи insrr 66
3.7.1 Функциональная взаимосвязь рецептора IRR с белком Lynx2 70
3.8 Анализ роли фосфолипазы С2 в сигнальном каскаде рецептора IRR 72
Выводы 79
Список сокращений и условных обозначений 80
Список литературы 85
