Введение
1. Инициация трансляции у эукариот 8
1.1 Механизмы инициации трансляции 8
1.1.1 Сканирующая модель 9
1.1.2 Внутренняя инициация трансляции 10
1.2 Канонические факторы инициации трансляции у эукариот 11
1.2.1 Факторы, участвующие в образовании 4 8S предынициаторного комплекса 12
1.2.2 Факторы, участвующие в образовании 80S комплекса eIF5 20
1.3 Неканонические транс-действующие факторы в инициации трансляции 21
1.4 Общая модель инициации трансляции у эукариот 35
2. Метод тоупринта в изучении сборки инициаторного комплекса из индивидуальных компонентов 38
1. р50 влияет на связывание 40S рибосомной субчастицы с инициаторным кодоном в сборке 4 8S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro 44
2. р50 способен стимулировать образование аберрантного 4 8S комплекса на 5-конце мРНК 51
3. Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков 51
4. р50 связывается с сахаро-фосфатным остовом мРНК, проявляя предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания 54
5. Связывание всего нескольких молекул р50 на молекулу (3-глобиновой мРНК достаточно для стимуляции образования 48S предынициаторного комплекса 58
6. р50- "менеджер" мРНК-белковых взаимодействий в мРНП млекопитающих 60
3 РТВ- активный участник инициации трансляции на IRES- элементе РНК вируса энцефаломиокардита 65
1. РТВ значительно усиливает сборку 48S инициаторного комплекса на РНК ВЭМК из очищенных компонентов in vitro 66
2 РТВ проявляет свойства РНК-шаперона 76
3. Функция РТВ в IRES-опосредованной инициации трансляции на РНК ряда пикорнавирусов специфична, но не распространяется на все пикорнавирусы 77
4 Материалы и методы
1. Реактивы и материалы 83
2 . Плазмидные конструкции 83
3 . Генноинженерные манипуляции 84
4 . Получение РНК-транскриптов 85
5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика 85
6. Реконструкция инициаторных комплексов из очищенных компонентов 85
6.1. Выделение рибосомных субчастиц и факторов инициации 85
6.2 Аминоацилирование инициаторной тРНК 86
6.3. Собственно сборка инициаторных комплексов 86
6.4. Тоупринт 86
7. Центрифугирование комплексов в сахарозном градиенте 87
8 Зондирование вторичной структуры мРНК 87
9. Иммуноблоттинг-анализ 87
10. Ультрафиолетовые сшивки 88
11. Количественная обработка результатов 88
Выводы. 89
