Введение
Обзор литературы 11
1. Бактериоцины 11
2. Микроцин С 17
2.1. Строение и регуляция синтеза микроцина С 17
2.2. Созревание и экспорт микроцина С 19
2.3. Импорт и механизм действия микроцина С 25
2.4. Иммунность клетки-продуцента к микроцину С 30
2.5. Биологическая активность микроцина С 32
3. mcc-подобные кластеры генов 35
3.1. Филогенетическое дерево предсказанных членов MccB/PaaA семейства белков 35
3.2. Аденилирование гомологов MccAEco in vitro и проверка их биологической активности. 38
3.3. Ингибирование Asp-RS гомологами микроцина С in vitro 39
Материалы и методы 40
1. Материалы 40
1.1. Штаммы 40
1.2. Питательные среды и антибиотики 41
1.3. Геномная ДНК 42
1.4. Плазмиды 42
2. Методы 43
2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 43
2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) 43
2.3. Электрофорез в агарозном геле 47
2.4. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) 47
2.5. Выделение РНК и обратная транскрипция 48
2.6. Выделение геномной и плазмидной ДНК 49
2.7. Очистка ДНК-фрагментов 49
2.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 49
2.9. Лигирование ДНК 49
2.10. Приготовление компетентных клеток E. coli 49
2.11. Трансформация E. coli 50
2.12. Приготовление компетентных клеток B. subtilis 168 и трансформация 51
2.13. Нокаут hns гена в E. coli 51
2.14. Выделение и очистка рекомбинантного белка 52
2.15. Реакции in vitro 53
2.16. Выделение и очистка McC и микроцин-С-подобных соединений 54
2.17. Приготовление клеточного лизата S30 54
2.18. Реакция ингибирования Asp-RS in vitro в лизатах клеток 55
2.19. Масс-спектрометрический анализ 55
2.20. Тест на чувствительность к McCYps 56
2.21. Компьютерные программы и приложения 57
Результаты и обсуждение 58
1. Описание mcc-подобных кластеров, кодирующих гомологи MccBЕco с дополнительным С-концевым доменом 58
2. Исследование функций генов кластера mccBam. 62
2.1. Проверка предсказания mcc-подобного кластера из B. amyloliquefaciens DSM7 in vivo 62
2.2. Сравнение нуклеотидной специфичности MccBX0Bam и MccBEco 64
2.3. Функция С-концевого домена MccBX0Bam белка MccX1Bam 67
2.4. Активность синтезированных пептидил-нуклеотидов 70
3. Исследование функций генов, входящих в кластер mccSeq 74
3.1. Белок MccBX0Seq и С-концевой домен белка MccE2X1Seq катализируют каскад реакций биосинтеза карбоксиметилированного пептидил-цитидилата 74
3.2. N-концевой домен белка MccE2X1Seq обеспечивает иммунность к пептидил нуклеотидным антибиотикам 77
4. Исследование функций генов, входящих в кластер mccYps 79
4.1. Белки MccBX0Yps и MccX1Yps осуществляют биосинтез карбоксиметилированного пептидил-цитидилата 79
4.2. Гетерологическая экспрессия mccYps-кластера 82
4.3. Делеционный анализ функции генов кластера mccYps 86
4.4. Выделение биоактивного микроцин-С-подобного соединения из Y. pseudotuberculosis IP 32953 89
4.5. Иммунность к McCYps. 93
4.6. Сравнение механизмов токсичности микроцинов С из E. coli и Y. pseudotuberculosis IP 32953 . 95
Заключение 98
Выводы 105
Список использованной литературы 106
Список сокращений и условных обозначений 117
Приложение 1 120
Приложение 2 124
Благодарности 132
