Оглавление
Список используемых сокращений и терминов ............................................................. 5
1 Введение .......................................................................................................................... 6
1.1 Актуальность работы ............................................................................................... 6
1.2 Цель и задачи исследования ................................................................................... 7
1.3 Научная новизна и практическая значимость работы .......................................... 8
1.4 Методология и методы исследования .................................................................... 9
1.5 Положения, выносимые на защиту ........................................................................ 9
1.6 Степень достоверности и апробация результатов .............................................. 10
1.7 Личное участие автора в проведении исследований .......................................... 11
1.8 Объем и структура диссертации ........................................................................... 12
2 Обзор литературы ......................................................................................................... 13
2.1 Эволюция половых хромосом и механизмы дозовой компенсации ................. 13
2.2 Регуляция дозовой компенсации у D. melanogaster ........................................... 18
2.2.1 Определение пола у D. melanogaster ................................................................. 18
2.2.2 Белок Sxl предотвращает образование КДК у самок ...................................... 24
2.3 Комплекс дозовой компенсации у D. melanogaster ............................................ 26
2.4 Структура КДК у D. melanogaster ........................................................................ 27
2.4.1 MSL1 ..................................................................................................................... 27
2.4.2 MSL2 ..................................................................................................................... 29
2.4.3 MSL3 ..................................................................................................................... 30
2.4.4 MOF ...................................................................................................................... 32
2.4.5 MLE ...................................................................................................................... 34
2.4.6 РНК roX ................................................................................................................ 36
2.5 Регуляция транскрипции Х-хромосомы у самцов D. melanogaster .................. 38
2.6 Модели активации транскрипции комплексом дозовой компенсации у самцов
D. melanogaster ............................................................................................................. 40
2.7 Механизмы специфичного рекрутирования КДК на Х-хромосому самцов D.
melanogaster .................................................................................................................. 42
3 Материалы и методы .................................................................................................... 46
3.1 Молекулярное клонирование ................................................................................ 46
3.1.1 Приготовление компетентных клеток .............................................................. 46
3.1.2 Трансформация бактериальных клеток ............................................................ 46
3.1.3 Выделение плазмидной ДНК из большого объёма бактерий ......................... 47
3.1.4 Выделение плазмидной ДНК из маленького объема бактериальной
культуры ........................................................................................................................ 48
3
3.1.5 Препаративная рестрикция ................................................................................ 48
3.1.6 Тупление выступающих концов ДНК ............................................................... 49
3.1.7 Горизонтальный гель-электрофорез ................................................................. 49
3.1.8 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля ............................................. 49
3.1.9 Переосаждение ДНК ........................................................................................... 50
3.1.10 Дефосфорилирование ДНК .............................................................................. 50
3.1.11 Лигирование ...................................................................................................... 50
3.2 Дрожжевая двугибридная система ....................................................................... 51
3.2.1 Использованный штамм дрожжей..................................................................... 51
3.2.2 Плазмиды для дрожжевой двугибридной системы ......................................... 51
3.2.3 Трансформация дрожжей ................................................................................... 51
3.3 Методы работы с рекомбинантными белками .................................................... 52
3.3.1 Использованные плазмиды ................................................................................ 52
3.3.2 Соосаждение рекомбинантных белков («pull down assay»)............................ 53
3.3.3 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле при денатурирующих условиях (SDS-PAGE) .................................................................. 54
3.4 Методы работы с культурой клеток Drosophila ................................................. 54
3.4.1 Использованная клеточная культура ................................................................ 54
3.4.2 Использованные плазмиды ................................................................................ 55
3.4.3 Коиммунопреципитация белков в S2-клетках ................................................. 55
3.4.4. Иммуноблот-анализ ........................................................................................... 56
3.5 Методы работы с линиями мух ............................................................................ 57
3.5.1 Использованные линии мух ............................................................................... 57
3.5.2. Использованные плазмиды ............................................................................... 57
3.5.3. Получение трансгенных линий дрозофил ....................................................... 58
3.5.4. Генетические скрещивания ............................................................................... 58
3.5.5. Подсчет выживаемости трансгенных линий мух ........................................... 58
3.5.6. Приготовление белкового экстракта из дрозофил .......................................... 59
3.6 Иммуноокрашивание политенных хромосом у дрозофилы .............................. 59
3.6.1. Приготовление препаратов политенных хромосом у дрозофилы ................ 59
3.6.2. Иммуноокрашивание политенных хромосом ................................................. 60
3.7 Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной ПЦР (кПЦР) ........................................................................................................................... 60
3.7.1. Приготовление хроматина для иммунопреципитации ................................... 60
3.7.2 Иммунопреципитация хроматина с последующей кПЦР ............................... 61
3.8 Работа с РНК ........................................................................................................... 62
4
3.8.1 Выделение РНК ................................................................................................... 62
3.8.2 Обратная транскрипция ...................................................................................... 62
3.8.3 ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени .......................... 63
4 Результаты ..................................................................................................................... 64
4.1 Картирование доменов, необходимых для взаимодействия друг с другом белков CLAMP и MSL2 ............................................................................................... 64
4.2 Исследование роли СХС-домена белка MSL2 в рекрутировании комплекса дозовой компенсации на Х-хромосому...................................................................... 71
4.3 Исследование роли домена MSL2, взаимодействующего с белком CLAMP, в рекрутировании КДК на Х-хромосому ...................................................................... 76
4.4 Исследование совместной роли ССД- и СХС-доменов белка MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому ...................................................................... 81
4.5 Исследование роли пролин-богатого домена (P-домен) и домена, богатого положительно заряженными аминокислотами (B-домен), в привлечении КДК на Х-хромосому ................................................................................................................. 85
4.6 Исследование роли СХС-, ССД- и P- доменов MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому ............................................................................................................ 89
4.7 Роль доменов MSL2 в экспрессии РНК roX ........................................................ 95
5 Обсуждение ................................................................................................................... 98
Выводы ........................................................................................................................... 102
Список цитированной литературы .............................................................................. 103
