Введение
1. Обзор литературы 18
1.1. Строение ЦфА 19
1.2. Внутриклеточный ЦфА: локализация и функции 21
1.3. Секреторный ЦфА 22
1.3.1. Секреторный ЦфА - хемоаттрактант и провоспалительный фактор 23
1.3.1.1. Строение рецептора CD147 24
1.3.1.2. CD147 - широко распространенный трансмембранный рецептор 25
1.3.1.3. Хемокиновая функция ЦфА реализуется за счет взаимодействия с CD147 26
1.3.2. Роль ЦфА в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и при оксидативных стрессах 27
1.3.3. Роль ЦфА в развитии онкологических заболеваний 28
1.3.3.1. Возможные функции ЦфА при злокачественных трансформациях 30
1.3.3.1.1. Стимуляция пролиферации 30
1.3.3.1.2. Стимуляция метастазирования 31
1.3.3.1.3. Фактор адаптации 32
1.3.3.1.4. Роль в индукции лекарственной устойчивости 32
1.3.3.2. Роль CD147 в развитии онкологических заболеваний 32
2. Материалы и методы 35
2.1. Животные 35
2.2. Облучение животных 35
2.3. Схема введения 5-фторурацила (5ФУ) 36
2.4. Получение рчЦфА 36
2.5. Схемы введения рчЦфА 36
2.6. Определение количества эндоколоний 38
2.7. Подготовка суспензий клеток 38
2.8. Подсчет лейкоцитов 39
2.9. Антитела 39
2.10. Цитофлуориметрический анализ клеток 40
2.11. Определение числа антителообразующих клеток (АОК) 40
2.12. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) 41
2.13. Реакция бласттрансформации (РБТ) 41
2.14. Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction, MLR) 42
2.15. Опухолевые штаммы 43
2.16. Оценка противоопухолевого действия рчЦфА 43
2.17. Оценка антиметастатического действия рчЦфА 44
2.18. Выделение матричной РНК (мРНК) 45
2.19. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) 46
2.20. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Realime ПЦР) 47
2.21. Последовательность праймеров 47
2.22. Иммуногистохимическое исследование 48
2.23. Иммунизация животных 49
2.24. Оценка уровня противоопухолевого иммунного ответа in vivo 49
2.25. Создание экспрессионной генетической конструкции для трансгенеза 49
2.26. Создание трансгенных животных 50
2.27. Анализ наличия трансгена методом ПЦР 50
2.28. Оценка эмбриотоксического действия экспрессионной конструкции pUC18-мЦфА 51
2.29. Изучение эмбриотоксического действия рчЦфА 51
2.30. Окрашивание скелета плода ализарином по методике Доусона 52
2.31. Статистическая обработка данных 52
3. Результаты исследования 53
3.1. Оценка влияния рчЦфА на субпопуляционный состав клеток костного мозга, крови и органов иммунной системы экспериментальных животных в норме и после воздействия высоких доз облучения и цитостатиков 53
3.1.1. Влияние рчЦфА на субпопуляционный состав клеток костного мозга и крови мышей в норме 53
3.1.2. Влияние рчЦфА на субпопуляционный состав органов кроветворной и иммунной систем мышей после облучения 57
3.1.2.1. Влияние рчЦфА на миграцию стволовых клеток костного мозга мыши 57
3.1.2.2. Анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови облученных мышей 59
3.1.2.3. Анализ субпопуляционного состава клеток костного мозга облученных мышей 62
3.1.2.4. Анализ субпопуляционного состава клеток селезенки облученных мышей 64
3.1.2.5. Анализ субпопуляционного состава клеток тимуса облученных мышей 67
3.1.3. Влияние рчЦфА на субпопуляционный состав органов кроветворной и иммунной систем мышей после воздействия химиопрепарата 71
3.1.3.1. Анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови мышей после введения 5ФУ 71
3.1.3.2. Анализ субпопуляционного состава клеток костного мозга мышей после введения 5ФУ 75
3.1.3.3. Анализ субпопуляционного состава клеток селезенки мышей после введения 5ФУ 78
3.1.3.4. Анализ субпопуляционного состава клеток тимуса мышей после введения 5ФУ 82
3.2. Оценка влияния рчЦфА на развитие иммунного ответа у интактных животных и у животных, подвергнутых воздействию высоких доз цитостатика или облучения 86
3.2.1. Оценка влияния рчЦфА на развитие иммунного ответа интактных мышей 86
3.2.1.1. Изучение влияния рчЦфА на развитие гуморального иммунного ответа 86
3.2.1.2. Изучение влияния рчЦфА на развитие клеточного иммунного ответа 87
3.2.1.3. Оценка митогенных свойств рчЦфА 88
3.2.1.4. Оценка сенсибилизирующих свойств рчЦфА 93
3.2.2. Оценка влияния рчЦфА на развитие иммунного ответа облученных мышей 96
3.2.3. Оценка влияния рчЦфА на развитие иммунного ответа мышей после воздействия 5ФУ 99
3.3. Оценка влияния рчЦфА на рост перевиваемых опухолевых штаммов различного гистогенеза in vivo 100
3.3.1. Оценка влияния рчЦфА на рост меланомы В16 101
3.3.2. Оценка влияния рчЦфА на рост карциномы легкого Льюис (LLC) 104
3.3.3. Оценка влияния рчЦфА на рост аденокарциномы Са 755 105
3.3.4. Оценка влияния рчЦфА на рост рака шейки матки РШМ-5 107
3.3.5. Оценка влияния рчЦфА на метастазирование LLC 112
3.4. Изучение механизмов противоопухолевого действия рчЦфА 115
3.4.1. Влияние рчЦфА на экспрессию генов ММР 115
3.4.2. Влияние рчЦфА на формирование сосудов в опухоли 117
3.4.3. Роль рчЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа 119
3.4.3.1. Оценка влияния рчЦфА на динамику отторжения клеток лимфомы EL-4 в мышах линии B10.D2(R101) 119
3.4.3.2. Оценка влияния рчЦфА на динамику отторжения клеток лимфомы EL-4 в мышах трансгенной линии 1D1b 124
3.5. Создание модели для оценки роли ЦфА как фактора микроокружения костного мозга, участвующего в дифференцировке стволовых клеток 127
3.5.1. Получение трансгенных мышей с повышенной экспрессией ЦфА в остеобластах 128
3.5.2. Оценка антенатального развития трансгенных эмбрионов 131
3.5.3. Создание трансгенных мышей с индуцируемой экспрессией ЦфА в остеобластах 132
3.5.4. Изучение эмбрио - и фетотоксического действия рчЦфА 134
4. Обсуждение результатов 140
4.1. Влияние рчЦфА на гемопоэз и иммунную систему интактных животных 140
4.2. Роль рчЦфА в восстановлении гемопоэтической и иммунной систем организма после сублетального облучения 142
4.3. Роль рчЦфА в восстановлении гемопоэтической и иммунной систем организма после воздействия цитостатика 145
4.4. Влияние рчЦфА на рост перевиваемых опухолевых штаммов in vivo 147
4.5. Механизмы противоопухолевой активности рчЦфА 151
4.6. Разработка трансгенной модели для изучения роли ЦфА как фактора микроокружения ГСК 157
4.7. Эмбриотоксическое действие рчЦфА 160
Заключение 162
Выводы 166
Список сокращений 167
Список литературы 170
Благодарности 194
