Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Салициловая кислота. Общая характеристика 12
1.2 Салицилат - ключевой интермедиат бактериальной деградации ряда ароматических соединений 12
1.2.1 Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений 13
1.2.2 Салицилат - промежуточный продукт деградации карбарила 15
1.2.3 Салицилат - ключевой промежуточный продукт микробной деградации нафталина, фенантрена и антрацена 16
1.3 Биохимические пути биодеградации салицилата 18
1.4 Разнообразие генетических систем деградации салицилата у бактерий 27
1.4.1 Организация генов катаболизма нафталина и салицилата плазмиды NAH7...27
1.4.2 Генетические системы катаболизма салицилата аналогичные пак-гсшм плазмиды NAH7 29
1.4.3 ш^-гены штаммов-деструкторов нафталина Ralstonia sp. штамм U2
и Polaromonas naphthalenivorans CJ2 31
1.4.4 Гены биодеградации салицилата штамма Polaromonas sp. JS666 33
1.4.5 hyb-гепы Pseudomonas aeruginosa JB2 и Achromobacter xylosoxidans A8 33
1.4.6 Гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingobium и родственных им родов 34
1.4.7 Гены катаболизма салицилата грам - положительной бактерии Streptomyces sp. WA46 35
1.5 Регуляция генов биодеградации салицилата.
Салицилат - индуктор экспрессии некоторых оперонов 36
1.6 Распространенней эволюция катаболических оперонов...37
2 Материалы и методы 39
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 39
2.2. Питательные среды и условия роста 41
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 41
2.4 Выделение тотальной ДНК бактерий 42
2.5. Выделение плазмидной ДНК 42
2.6. Приготовление блок-вставок 43
2.7. Конъюгационный перенос плазм ид 44
2.8. Полимеразная цепная реакция 44
2.9. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 46
2.10. Электрофорез в агарозном геле 46
2.11. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 47
2.12 Мечение ДНК методом рассеянной затравки 47
2.13 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах 48
2.14. Лигирование ДНК 48
2.15. Приготовление компетентных клеток E.coli 48
2.16 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК 49
2.17 Определение нуклеотиднои последовательности ДНК 49 -
2.18 Определение удельных активностей ферментов 50
2.19 Выделение тотальной РНК 50
2.20 Синтез первой цепи кДНК 51
2.21 Картирование стартовой точки транскрипции 52
3 Результаты 53
3.1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов салицилата 53
3.2. Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата 55
3.3. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации салицилата 57
3.4. Амплификация ключевых генов биодеградации салицилата 59
3.5. Поиск последовательностей, отвечающих за утилизацию салицилата, в исследуемых штаммах 60
3.6. Анализ генов nahGl штаммов-деструкторов салицилата 62
3.7. Изучение экспрессии гена nahGl у исследуемых штаммов 64
3.8. Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P. putida 66
3.9. Анализ генов nahUштаммов-деструкторов салицилата 67
3.10. Деградация салицилата штаммом P. putida АК5 69
3.11. Клонирование генов катаболизма нафталина плазмиды рАК5 69
3.12. Клонирование генов катаболизма салицилата плазмиды рАК5 70
3.13. Анализ нуклеотидной последовательности
генов биодеградации салицилата плазмиды рАК5 72
4. Обсуждение 84
Выводы 95
Список литературы
