Введение
1. Общие принципы инициации транскрипции 9
1.1. Организация промотора Ю
1.2. Нуклеосомная организация промотора 14
1.3. Сборка преинициаторного комплекса 17
2. Общий фактор транскрипции TFIID 18
2.1. ТВР 21
2.2. Структура TFIID 24
2.3. Ферментативные активности субъединиц TFIID 26
3. Ремоделирование хроматина 27
3.1. Классификация ремоделирующих комплексов 28
3.2. SWI/SNF семейство 30
3.3. Доменная структура субъединиц ВАР и РВАР комплексов 31
3.3.1. Домены, опосредующие белковые взаимодействия 32
3.3.2. ДНК-связывающие домены 34
3.3.3. Актин как компонент SWI/SNF комплексов 35
3.4. Функции ВАР и РВАР комплексов 37
3.5. Механизм действия SWI/SNF комплексов 39
4. Упорядоченное рекрутирование: ген-специфичный механизм активации транскрипции 42
Экспериментальная часть 47
1. Объекты и задачи исследования 47
2. Материалы и методы 49
2.1. Материалы. 49
2.1.1. Штаммы и вектора Е. Coli . 49
2.1.2. Клеточные линии. 49
2.1.3. Работа с дрозофилами 49
2.1.4. Бактериальные среды 50
2.1.5. Ферменты и реактивы 5 0
2.1.6. Антитела 50
2.1.7. Праймеры 50
2.2. Работа с клетками 51
2.2.1. Трансформация S2 клеток 51
2.2.2. РНК интерференция 52
2.3. Работа с ДНК 52
2.3.1. Приготовление компетентных клеток 52
2.3.2. Трансформация бактерий 53
2.3.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 53
2.3.4. Обработка ДНК рестриктазами 54
2.3.5. Лигирование 54
2.3.6. Вьщеление геномной ДНК из мух 54
2.3.7. Гель-электрофорез ДНК. 55
2.3.8. ПЦР (PCR) 55
2.3.9. Секвенирование ДНК 55
2.4. Работа с РНК 55
2.4.1. Получение двухцепочечной РНК 55
2.5. Работа с белками 5 7
2.5.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 57
2.5.2. Получение антител и их очистка 57
2.5.3. Белковый гель-электрофорез 57
2.5.4. Вестерн-блот анализ 57
2.5.5. Соосаждение беклов антителами (иммунопреципитация) 58
2.5.6. Дот-блот анализ 58
2.5.7. Получение белковых экстрактов из S2 клеток 59
2.5.8. Выделение эмбрионального ядерного экстракта 59
2.5.9. Хроматографическая очистка комплекса 59
2.5.10. Гель-фильтрация 59
2.5.11. Фингер-принтный анализ с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии 60
2.6. Иммуноокрашивание политенных хромосом 60
2.7. Хроматиниммунопреципитация (СЫР) 61
2.8. Использованное программное обеспечение. 62 3. Результаты 64
3.1. Очистка SAYP-содержащего комплекса из ядерного экстракта эмбрионов 63
3.2. Анализ компонентов комплекса: 66
3.2.1. Результаты фингер-принтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии 66
3.2.2. Коиммунопреципитация компонентов комплекса 68
3.2.3. Истощение 69
3.3. Иммуноокрашивание политенных хромосом 70
3.4. Распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SAYP-зависимых генов 71
3.5. Влияние «нокдаунов» компонентов комплекса на связывание общего комплекса с промоторами SAYP-зависимых генов: 72
3.5.1. Влияние «нокдауна» SAYP на распределение компонентов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов 72
3.5.2. Влияние «нокдауна» ВАР 170 на распределение SAYP и компонентов комплексов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов
3.5.3. Влияние «нокдауна» TAF4 на распределение SAYP и компонентов 74
TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов
4. Обсуждение результатов 76
Выводы 78
Благодарности
Список литературы
