Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Классы сайт-специфических дезоксирибонуклеаз 13
1.2. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов 14
1.3. ОЕС хоминг-эндонуклеаз І являются мобильными генетическими элементами 23
1.4. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 25
1.4.1. Семейство бактериофагов Т4-типа на примере бактериофага Т4 25
1.4.1.1. Классификация фагов Т4-типа. Исключение фагом Т4 близкородственных фагов 25
1.4.1.2. Особенности структуры ДНК бактериофага Т4 29
1.4.1.3. Особенности развития бактериофага Т4 31
1.4.2. Кодируемые нитронами хоминг-эндонуклеазы фага Т4 36
1.4.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 внеинтронной локализации 37
1.4.4. Транскрипция кластера генов тРНК бактериофага Т4 41
1.4.5. Регуляция экспрессии генов хоминг-эндонуклеаз фагаТ4 42
1.5. Практическое применение хоминг-эндонуклеаз 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Материалы 49
2.1.1. Штаммы бактерий и бактериофаги 49
2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды 51
2.1.3. Праймеры 57
2.1.4. Среды, основные буферы и растворы 59
2.1.5. Материалы и реактивы 63
2.2. Методы исследования 64
2.2.1. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации 64
2.2.2. Получение геномной ДНК 66
2.2.3. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация 67
2.2.4. Получение электрокомпетентных клеток Pseudomonas и электропорацня 68
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПНР) 68
2.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК 69
2.2.7. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК 70
2.2.8. Анализ рекомбинантных клонов 70
2.2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 71
2.2.10. Электрофорез белков в ПААГ 72
2.2.11. Экспрессия ОРС segB 72
2.2.12. Очистка эндонуклеазы SegB и определение концентрации белка 73
2.2.13. Определение эндонуклеазной активности SegB in vitro 73
2.2.14. Определение точек расщепления и границ сайта узнавания SegB 74
2.2.15. Конструирование бактериофага B20Ase,gB 75
2.2.16. Получение Т-четных бактериофагов и титрование 75
2.2.17. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным ультрацентрифугированием в градиенте CsCl 76
2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства 76
2.2.19. ДНК-ДНК гибридизация (гибридизация по Саузерну) 77
2.2.28. Программное обеспечение 79
2.2.29. Конъюгативный перенос плазмид 79
2.2.30. Введение ОРС segB и segD в хромосому штамма PAOl P. aeruginosa и segD в хромосому штамма Q8rl-96 P. Jluorescens 81
2.2.31. Экспрессия генов segB и segD в клетках штаммов YAOsegB и VAOsegD
P. aeruginosa 81
2.2.32. Внесение делеций в хромосому штаммов ^AOsegB[phzS::Tc] и PAOsegD[phzS::Tc] P. aeruginosa 82
2.2.33. Измерение частоты возникновения спонтанньк мутаций в штаммах РА01 и Aeruginosa 82
2.2.34. Фенотипический анализ штамма Q8rl-96 P. Jluorescens и полученных на его основе мутантов 83
2.2.34.1. Приготовление культуры и ее тестирование 83
2.2.34.2. Проведение морфологического сравнения колоний 83
2.2.34.3. Анализ способности клеток использовать в качестве источников углерода различные соединения 83
2.2.34.4. Измерение кинетических параметров роста 83
2.2.34.5. Анализ способности продуцировать сидерофоры и экзопротеазу 84
2.2.34.6. Анализ способности продуцировать 2,4-диацетилфлороглюцинол 84
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение..- 85
3.1. Поиск сайта гидролиза для эндонуклеазы SegB в популяции Т-четных бактериофагов 85
3.2. Определение структуры кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L 86
3.3. Ген segB кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу 90
3.4. Биохимические особенности эндонуклеазы SegB 91
3.5. Предпочтительный сайт расщепления SegB находится в последовательности гена тРНК^" Т-четных фагов 98
3.6. Определение точек гидролиза и границ сайта узнавания SegB в области гена тРНКАя1фага,Г2Ь 99
3.7. Определение точек расщепления эндонуклеазой SegB в последовательностях отдельных генов тРНК фага T2L и реконструирование сайтов узнавания 102
3.8. Анализ специфичности SegB на гликозилированной ДНК фагов Т4 и T2L 105
3.9. Эндонуклеаза SegB инициирует нереципрокный генетический обмен между бактериофагами Т4 и Т2 109
ЗЛО. Изучение возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas 114
3.10.1. Специфичность SegB при гидролизе геномной ДНК бактерий P. aeruginosa иЕ. coli 114
3.10.2. Разработка системы направленного мутагенеза с использованием. хоминг-эндонуклеазы SegB или SegD и тестирование ее в штамме PAOl P. aeruginosa 116
3.10.3. Внесение делеции в геном P. aeruginosa штаммов VAOsegB\phzS::Tc] и PAOsegD\phzS::Tc] за счет внутрихромосомной рекомбинации, инициируемой эндонуклеазами SegB или SegD 124
3.11. Тестирование системы Seg-индуцированного направленного мутагенеза с использованием эндонуклеазы SegD в штамме Q8rl-96 P.fluorescens 128
Заключение 133
Выводы 136
Список литературы
