Введение
Обзор литературы 11
1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов 11
2. Протеолитические ферменты микроорганизмов 13
2.1. Сериновые протеиназы 13
2.2. Цистеиновые протеиназы 15
2.3. Аспарагиновые протеиназы 16
2.4. Металлопротеиназы 16
2.5. Бактериальные внеклеточные цинксодержащие металлопротеазы 18
3. Механизмы регуляции протеолитических ферментов 21
3.1. Роль протеолитических ферментов в биологической регуляции 21
3.2. Механизмы активации зимогена 22
3.3. «Цистеиновый свитч» 22
3.4. Регуляция активности бактериальных протеиназ 24
3.5. Организация генов бактериальных протеиназ 24
3.6. Контроль генетической экспрессии на уровне транскрипции и трансляции 26
3.7. Посттрансляционные модификации протеиназ 27
3.8. Внеклеточные бактериальные протеазы и из роль в патогенезе 30
3.9. Взаимодействие протеиназ с ингибиторами 30
3.10. Другие факторы, контролирующие активность протеиназ 33
4. Ограниченный протеолиз 35
4.1. Ограниченный протеолиз как метод исследования структуры и функции белков 35
4.2. Актин и его протеолиз 37
4.3. Протеолиз актина бактериальной протеазой ЕСР32 38
5. Механизмы бактериальной инвазии 41
5.1. Инвазирующие бактерии 43
5.2 Инвазирующие бактерии, проникающие в цитоплазму 44
5.3. Генетические основы инвазии бактерий Sh. flexneri 48
5.4. Организация генов Sh. flexneri на большой вирулентной плазмиде 48
5.5. Хромосомные гены бактерий, связанные с вирулентностью 51
Материалы и методы 53
1. Бактериальные штаммы, использованные в работе, условия культивирования 53
2. Клеточные линии и условия культивирования 54
3. Получение актина скелетных мышц кролика 54
4. Определение протеолитической активности 55
5. Клонирование гена гримелизина 55
6. Определение сайта расщепления актина 56
7. Заражение эукариотических клеток бактериями 57
8. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 57
9. Оценка количественной инвазии бактерий 57
10. Саузерн-гибридизация ДІЖ 5 8
11. Аффинная очистка белков 58
12. Методы компьютерного анализа 59
Результаты и обсуждения 60
1. Ограниченный протеолиз актина и инвазивный фенотип бактерий, подвергшихся действию фуразолидона 60
1.1. Инвазивные свойства непатогенного мутанта Shigella flexneri 5а2с, полученного под действием фуразолидона 60
1.2. Анализ клинических изолятов ZF3, ZF7, и ZF53, полученных
от пациентов, длительно лечившихся фуразолидоном 64
2. Исследование распространения ЕСР-подобной протеолитической активности в различных бактериях
2.1. Выявление ЕСР32-подобной активности в энтеробактериях 72
2.2. Количественная инвазия штаммов энтеробактерий, обладающих и не обладающих ЕСР32/гримелизин-подобным фенотипом 74
3. Клонирование гена протеазы и характеристика фермента 76
3.1. Идентификация штамма А2, продуцента протеазы ЕСР 32 76
3.2. Последовательность гена гримелизина из штаммов-продуцентов Serratia grimesii А2 и Serratia grimes И 30063 DZMO 81
3.3. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на N-конце 86
3.4. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на С-конце 87
3.5. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком 89
3.6. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком 91
3.7. Определение сайта расщепления актина рекомбинантным гримелизином 92
3.8. Очистка рекомбинантного гримелизина на Ni-содержащих аффинных носителях 94
3.9. Очистка рекомбинантного гримелизина в денатурирующих условиях 95
3.10. Анализ ДНК энтеробактерий 97
4. Анализ инвазии рекомбинантных штаммов-продуцентов гримелизина 99
4.1. Анализ инвазии по данным конфокальной микроскопии 99
4.2. Количественная инвазия рекомбинантных штаммов 103
Заключение 105
Выводы
По список литературы 111
