Введение
Обзор литературы 11
Гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a 11
Структура и функции HNF4a 11
Структура белка 12
Структура гена и изоформы 12
Модуляция транс-активационных функций изоформ 14
Функции HNF4a 15
Метаболизм 16
Клеточная адгезия иморфогенная активность 16
Регуляция клеточного цикла 17
Дифференцировочный фактор 17
Диабет 18
Гепатоканцерогенез 18
Специфичность экспрессии и роль HNF4a на отдельных этапах онтогенеза 19
Ранний эмбриогенез 19
Поздний эмбриогенез и взрослый организм 21
Регуляция экспрессии гена HNF4a 23
Регуляция активности промотора Р1 24
Регуляция активности промотора Р2 26
Факторы, участвующие в регуляции экспрессии HNF4a 27
Печеньспецифические факторы транскрипции 27
HNF1 28
С/ЕВР 29
FoxA(HNF3) 30
HNF6(Onecut) 31
FTF 31
COUP-TF 32
GATA 32
Нетканеспецифические аспекты регуляции активности HNF4a 32
Опухолевый супрессор р53 33
Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки 35
Последствия инактивации р53 у мышей 35
Негативная регуляция АФП белком р53 36
Негативная регуляция экспрессии HNF4aPl белком р53 37
Трансформирующий фактор роста (TGFP) 37
TGFP лиганд 38
Рецепторы TGFP 39
Белки Smad 42
TGFp сигнальный путь 43
Альтернативные сигнальные пути 45
TGFp-зависимая регуляция экспрессии HNF4a 46
Кооперация р53 и TGFP сигнальных путей 48
Материалы и методы
Список использованных растворов и сред 51
Животные 52
Клеточные линии 52
Плазмидные конструкции 53
Трансформация клеток Е. Coli 53
Трансфекция и инфекция клеток линии HepG2 53
Анализ активности репортерного гена люциферазы 54
Выделение РНК 54
Выделение высокомолекулярной геномной ДНК 55
Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 55
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ) 55
Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a мыши 57
Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a человека и направленный мутагенез 58
Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 60
Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов 60
Вестерн-Блот гибридизация 61
Результаты и обсуждение 63
В печени взрослых р53 мышей происходит активация экспрессии эмбриональной изоформы HNF4a7 64
Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4aP2 67
Снижение уровня р53 вызывает активацию промотора Р2 в культуре клеток HepG2 70
Биоинформатический анализ нуклеотидной последовательности промоторного элемента Р2 гена HNF4a мыши и человека 76
Действие цитокинов TGFpi и TGFP2 проводит к изменению баланса экспрессируемых изоформ HNF4a в культуре клеток HepG2 78
Компоненты TGFp сигнального пути активируют промотор Р2 напрямую, в то время как репрессия промотора Р1 происходит опосредованно дополнительными факторами 82
Факторы TGFpi и TGFp2 способны активировать экспрессию репортерного гена под контролем Р2 промотора HNF4a мыши 86
Ингибирование передачи сигнала от рецептора TGFP препятствует подавлению синтеза HNF4aPl и активации HNF4aP2 88
Направленный мутагенез предполагаемого сайта связывания Smad в промоторе Р2 гена HNF4a человека не приводит к изменению активности этого промотора под действием TGFP2 90
Ингибирование МЕК сигнального пути блокирует TGFp-зависимое подавление экспрессии изоформ HNF4aPl, но не влияет на активацию HNF4aP2 95
Возможная кооперация р53 и TGFp-сигнальных путей в регуляции транскрипции HNF4a 100
Заключение 102
Выводы 105
Приложение 106
Благодарности 107
Список литературы
