Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1 Общее представление о бактериях рода Lactobacillus 7
1.2 ТА системы: общая характеристика и классификация 15
1.3 Механизм действия и биомишени токсинов ТА систем 23
1.4 Функции ТА систем 26
1.5 Области применения ТА систем 29
1.6 Разнообразие ТА систем II типа 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1 Штаммы и условия культивирования 37
2.2 Выделение ДНК 43
2.3 Конструирование праймеров и проведение ПЦР 44
2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля 55
2.5 Секвенирование ДНК 55
2.6 Биоинформатический анализ 55
2.7 Клонирование генов ТА систем в экспрессионные векторы 56
2.8 Определение активности ТА систем в клетках E.coli 58
2.9 Выделение РНК 2.10 Обратная транскрипция 59
2.11 Количественная ПЦР в режиме реального времени 59
2.12 Удлинение праймера (Primer extention) 60
2.13 Определение точки начала транскрипции при помощи специфической амплификации концевых фрагментов кДНК (RLM-RACE) 60
2.14 Создание lacZ-транскрипционных конструкций (fusions) и определение функционирования промоторов по активности Р-галактозидазы в клетках В.subtilis 61
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 62
3.1 Видовая идентификация штаммов лактобацилл из лабораторной коллекции 62
3.2 Биоинформатический поиск и структура модулей ТА систем суперсемейства RelBE типа в секвенированных геномах лактобацилл 70
3.3 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE 73
3.3.1 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.rhamnosus з
3.3.2 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.casei 77
3.3.3 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.helveticus 78
3.4 Изучение функционирования ТА систем лактобацилл в клетках E.coli 88
3.4.1 Клонирование и экспрессия в клетках Е.coli ТА генов L.rhamnosus 88
3.4.2 Клонирование и экспрессия в клетках Е.coli ТА генов L.helveticus 90
3.4.3 Клонирование и экспрессия в клетках Е.coli гена токсина L.casei 94
3.5 Изучение регуляции экспрессии ТА системы YefM-YoeB у штаммов L.rhamnosus 95
3.5.1 Особенности проксимального и дистального районов ТА системы YefM-YoeBLrh .95
3.5.2 Идентификация сайтов инициации транскрипции в ТА системе YefM-YoeBLrh .97
3.5.3 Исследование активности предполагаемых промоторов 99
3.5.4 Изучение транскрипционной активности генов уегМ-уоеВьл в стрессовых условиях методом RTq PCR 100
3.6 Поиск и характеристика новых ТА систем у L.helveticus 105
3.6.1 Поиск новых ТА систем в секвенированных геномах L.helveticus 105
3.6.2 Идентификация и полиморфизм новых ТА систем в штаммах L.helveticus из лабораторной коллекции 106
3.6.3 Клонирование и экспрессия в клетках E.coli генов новых ТА систем L.helveticus109
3.7 Системы ТА суперсемейства RelBE как биомаркеры для идентификации штаммов лактобацилл 113
Заключение 116
Выводы 117
Список сокращений, использованных в работе 118
Список литературы 119
