Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги 9
1.1.1. Метаболизм пуринов. Сравнительная характеристика метаболизма пуринов у Е. coli и S. cerevisiae 10
1.1.1.1.Биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo 13
1.1.1.2.Утилизация и взаимопревращение пуринов 20
1.1.2. Мутагенные аналоги пуринов. Механизм действия мутагенных предшественников ДНК 24
1.1.3. 6-гидроксиламинопурин 31
1.2. Использование функциональной геномики для масштабного поиска генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов Е. coli и S. cerevisiae к различным мутагенам 37
1.3.Постановка задачи 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе 45
2.1.1. Штаммы бактерий... 45
2.1.2. Штаммы дрожжей 46
2.1.3. Плазмиды 47
2.2. Среды и условия культивирования 47
2.3. Реактивы 49
2.4. Методы генетики микроорганизмов 49
2.4.1. Бактерии 49
2.4.1.1. Стандартные генетические методы 49
2.4.1.2. Качественный тест на токсичное и мутагенное действие аналогов 49
2.4.1.3. Количественный тест на индукцию прямых мутаций в гене Rif. 50
2.4.1.4. Тестирование штаммов на чувствительность к хлорату калия 50
2.4.1.5. Создание геномной библиотеки инсерционных мутантов Е. coli 51
2.4.1.6. Анализ бактериальных геномных библиотек с целью выявления генов, контролирующих чувствительность к ГАП 52
2.4.2. Дрожжи 54
2.4.2.1. Стандартные генетические методы 54
2.4.2.2. Получение штаммов дрожжей 54
2.4.2.3. Тестирование мутагенной активности аналогов оснований 56
2.4.2.4. Тестирование чувствительности клеток дрожжей к токсичному действию ЭМС и УФ-света 57
2.4.2.5. Геномный скрининг с использованием дрожжевой библиотеки делеционных мутантов для поиска штаммов, чувствительных к ГАП 58
2.5. Молекулярно-генетические методы 60
2.5.1. Стандартные молекулярно-генетические методы 60
2.5.2. Идентификация места инсерции транспозона EZ-Tn5 в хромосоме Е. coli 60
2.6. Статистические методы 61
ГЛАВА 3. Результаты 62
3.1. Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий Е. coli 62
3.1.1. Создание и анализ случайных геномных библиотек инсерционных мутантов Е. coli 62
3.1.2. Результаты скрининга геномных библиотек случайных инсерционных мутантов у бактерий 63
3.1.2.1. Гены, инактивация которых приводит к повышению чувствиельности клеток к ГАП 66
3.1.2.2. Ген YhhP принадлежит МоКо-зависимому пути детоксикации
3.1.2.3. Ген Fre контролирует новый МоКо-независимый путь детоксиеации ГАП 73
3.1.2.4. Анализ ауксотрофов 77
3.1.2.5. Гены, инактивация которых приводит к супрессии ГАП8-фенотипа у мутантов усЪХ. 79
3.2. Геномный скрининг с целью выявления генов, контролирующих чувствительность дрожжей S. cerevisiae к ГАП 81
3.2.1. Подбор условий для скрининга дрожжевой делеционной библиотеки 81
3.2.2. Результаты скрининга дрожжевой библиотеки делеционных мутантов 83
3.2.3. Проверка чувствительности ГАП , мутантов идентифицированных в геномном скрининге, к действию других мутагенов 87
3.3. Изучение влияния мутаций в генах ade4, adel6, adel7u adel3 на чувствительность клеток дрожжей к ГАП 89
3.4. Идентификация генов, отвечающих за активацию ГАП у дрожжей...92
ГЛАВА 4. Обсуждение 96
4.1. Генетический контроль чувствительности Е. coli к мутагенному и токсичному действию ГАП 96
4. 2. Генетический контроль чувствительности дрожжей S. cerevisiae к мутагенному и токсичному действию ГАП 107
4. 3. Сравнение генетического контроля ГАП-индуцированного мутагенеза у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae 115
Выводы 119
Список литературы
