Введение
Глава I. Генетический контроль метаболизма углерода, азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Обзор литературы) 17
1.1. Генетические механизмы регуляции метаболических путей и принципы построения регуляторных моделей у эукариот 17
1.2. Метаболизм углерода и генетические механизмы, обеспечивающие адаптацию клеток дрожжей S. cerevisiae к наличию и отсутствию глюкозы в среде 20
1.2.1. Транспорт глюкозы и пути переноса сигнала о наличии глюкозы в среде 22
1.2.1.1. Семейство генов НХТ и регуляция их транскрипции 22
1.2.1.2. Система мембранных рецепторов глюкозы, взаимодействующих с ГТФ - связывающими белками 27
1.2.2. Генетический контроль глюкозной индукции генов, кодирующих ферменты гликолиза 29
1.2.3. Генетический контроль регуляции глюкозной репрессии 32
1.2.3.1 .Репрессор Miglp 35
1.2.3.2. Структура и функции регуляторного комплекса SNF1 37
1.2.3.3. Регуляция экспрессии гена ADH2, кодирующего структуру алкогольдегидрогеназы 40
1.2.3.4. Регуляция транскрипции генов, кодирующих ферменты цикла Кребса 42
1.3. Генетический контроль метаболизма азота у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 44
1.3.1. Роль источников азота в регуляции продолжительности стадий клеточного цикла у дрожжей S. cerevisiae 44
1.3.2. Центральный путь азотного метаболизма у дрожжей 45
1.3.3. Генетический контроль регуляции основных ферментов азотного метаболизма ... 47
1.3.3.1. Регуляция транскрипции GLN1 48
1.3.3.2. Регуляция транскрипции GDH1 48
1.3.3.3. Регуляция транскрипции GDH2 49
1.3.3.4. Регуляция транскрипции GLT1 49
1.3.4. Генетический контроль азотной катаболитной репрессии 50
1.3.4.1. Белки-регуляторы азотного метаболизма 51
1.3.5. Пути передачи информации о количестве и качестве источника азота в среде у дрожжей 55
1.3.5.1. Филаментозный рост у дрожжей-сахаромицетов - как примергенетического контроля формирования адаптивных модификаций 56
1.3.5.2. Система, воспринимающая пищевые сигналы (SPS) 60
1.3.5.3. Дискриминационный путь 61
1.3.6. Генетический контроль утилизации пролина 63
1.4. Генетический контроль метаболизма фосфора у дрожжей S. cerevisiae 65
1.4.1. Метаболизм фосфора у дрожжей 65
1.4.2. Биохимическая характеристика КФ 67
1.4.3. Генетический контроль регуляции кислых фосфатаз дрожжей ПГЛ 68
1.4.3.1. Генетический контроль синтеза КФ 1 69
1.4.3.2. Генетический контроль синтеза КФ2 и КФЗ 69
1.4.4. Механизмы мембранного транспорта Ф„ у дрожжей 73
1.4.5. Пути передачи сигнала о концентрации фосфата 75
1.4.6. Регуляторные белки регулонаРНО 76
1.4.6.1. Позитивные регуляторы 76
1.4.6.2. Негативные регуляторы 82
1.4.6.3. Модель регуляции экспрессии генов регулона PHO 88
Глава II. Материалы и методы
2.1. Основные обозначения 92
2. 2. Основные штаммы и условия их культивирования 93
2. 2.1. Штаммы и плазмиды 93
2. 2. 2. Условия культивирования штаммов 94
2.3. Методы
2.3.1 .Генетические методики 98
2.3.2. Биохимические методики 98
2.3.2.1 . Определение активности кислых фосфатаз 98
2.3.2.2. Качественное определение уровня гликогена 98
2.3.2.3.Определение активности р - галактозидазы у дрожжей 99
2.3.2.4. Приготовление экстракта белков дрожжей S. cerevisiae 99
2.3.2.5. Гибридизация белков с фрагментом промотора гена СІТІ 99
2.3.2.6. Выделение и очистка тропомиозина в составе фракции
термостабильных белков 100
2.3.3. Цитологические методики
2.3.3.1. Визуализация митДНК с помощью DAPI 101
2.3.3.2. Окраска дрожжей родамин - фаллоидином 101
2.3.3.3. Получение и обработка цифровых изображений 102
2.3.4. Молекулярно-биологические методики
2.3.4.1. ПЦР с праймерами к гену РН085 102
2.3.4.2. Секвенирование фрагментов ДНК 103
2.3.5. Статистическая обработка результатов 103
Глава III. Результаты и обсуждение
3.1. Структурно-функциональная характеристика киназы Pho85p и генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 104
3.1.1. Установление аллельности генов АСР82 и РН085 104
3.1.2. Фенотипическая характеристика мутантов pho85 105
3.1.3. Структурно -функциональный анализ мутаций pho85 106
3.1.4. Поиск генов, кодирующих шапероны комплекса Pho85p-Pho80p 108
3.1.4.1. Генетический анализ спонтанных супрессорных мутаций, подавляющих проявление pho85-3 и pho85- 7 110
3.1.4.2. Рекомбинационный тест мутаций DSP 113
3.1.5. Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 115
3.1.5.1. Генетическая нестабильность ядерного и митохондриального геномов - новый плейотропный эффект мутаций pho85 121
3.1.5.1.1. Определение количества генов, в которых возникают мутации ts на фоне дизрупции гена РН085 123
3.1.5.1.2. Влияние дизрупции гена РН085 на распределение митохондриальных нуклеоидов между материнской клеткой и почкой 126
3.1.5.1.3. Влияние дизрупции РН085 на структуру цитоскелета 127
3.1.5.1.4. Влияние дизрупции РН085 на спектр термостабильных белков 130
3.2. Поиск регуляторних путей, связывающих метаболизм азота и фосфора у дрожжей 139
3.2.1. Изучение роста мутантов pho на средах с различными источниками азота 139
3.2.2. Генетический анализ признака Pro" - "неспособность к утилизации пролина" 140
3.2.3. Влияние мутаций pho85 на транспорт пролина 141
3.2.4. Влияние мутаций pho4 на рост pho85 мутантов на среде с пролином 144
3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов генов катаболизма пролина 145
3.3. Поиск регуляторних путей, связывающих метаболизм углерода и фосфора у дрожжей S. cerevisiae 148
3.3.1.Определение зависимости экспрессии гена СІТІ от концентрации фосфата и дизрупции гена РН085 149
3.3.2 Поиск белков, взаимодействующих с областью промотора гена СІТІ, ответственной за глюкозную репрессию 151
3.4. Зависимость экспрессии гена HSP82, кодирующего структуру белка-шаперона от концентрации фосфата в среде и мутаций в генах
РНО 158
3.4.1. Получение изогенных CSG55 штаммов с мутациями в генах РНО и их генетический анализ 161
3.4.2. Влияние концентрации фосфата и мутаций в генах РНО на транскрипцию HSP82 162
3.5. Идентификация ортолога гена РН085 дрожжей Pichia pastoris 168
3.5.1. Получение штаммов с дизрупцией гена РН085 у дрожжей P. pastoris 169
3.5.2. Изучение фенотипического проявления дизрупции в гене РН085Рр 171
3.5.3. Изучение функций ортологов Pho85p у представителей разных эволюционных групп 173
Глава IV. Роль фосфопротеинкиназ Pho85p, Snflp, Torl,2 в реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей (Заключение) 182
4.1. Координация метаболизма в ответ на лимитирующий фактор 185
4.1.1. Координация метаболизма при азотном голодании 186
4.1.1.2. Изменения метаболизма углерода в ответ на недостаток азота 187
4.1.1.3. Недостаток азота и метаболизм фосфора 188
4.1.2. Координация метаболизма при недостатке источника углерода 189
4.1.2.1. Глюкозное голодание и метаболизм азота 190
4.1.2.2. Глюкозное голодание и метаболизм фосфора 191
5.1.3. Координация метаболизма при недостатке фосфора 192
5.1.3.1. Недостаток фосфата и метаболизм азота 193
5.1.3.2. Недостаток фосфата и метаболизм углерода 193
5.2. Влияние лимитирующего фактора на клеточный цикл 195
5.3. Лимитирующий фактор и его роль в формировании « адаптивных» мутаций 198
Выводы 202
Список литературы
