Введение
1. Обзор литературы. Генетика метаболизма хлорофиллов 18
1.1. Природные тетрапирролы и их производные 19
1.2. Хлорофиллы 20
1.2.1. Исторический очерк 21
1.2.2. Формы хлорофиллов 23
1.3. Генетика биосинтеза хлорофиллов. Достижения и проблемы 27
1.3.1. Ферменты биосинтеза хлорофилла. Генетические исследования 32
1.3.1.1. Синтез АЛК 32
1.3.1.2. Синтез протопорфирина IX из АЛК 36
1.3.1.3. Магниевая ветвь биосинтеза тетрапирролов. Ранние этапы образования хлорофиллов 41
1.3.1.4. Заключительные стадии биосинтеза хлорофиллов 47
1.4. Превращения протохлорофиллида: темновой и светозависимый пути... 51
1.4.1. Протохлорофиллид в цепи биосинтеза хлорофиллов 52
1.4.2. Биосинтез хлорофиллов в темноте. Генетические исследования 54
1.4.3. Светозависимый биосинтез хлорофиллида 64
1.4.4. Эффективность биосинтеза хлорофиллов в темноте и на свету 70
1.4.5. Проблемы и перспективы изучения темнового биосинтеза ХЛ 71
1.5. Катаболизм хлорофиллов 74
1.5.1. Образование окрашенных катаболитов хлорофиллов 76
1.5.2. Образование неокрашенных катаболитов 77
1.6. Эволюционные аспекты метаболизма хлорофиллов 79
1.7. Генетические аспекты световой и метаболической регуляции биосинтеза хлорофиллов 84
1.7.1. Регуляторные механизмы биосинтеза хлорофилла з
1.7.2. Свет - регулятор экспрессии генов, кодирующих белки фотосинтеза 87
1.7.3. Регуляция светом. Посттрансляционный уровень 95
1.7.4. Белки ELIP регулируют уровень синтеза хлорофиллов 96
1.7.5. Координация экспрессии генов ядра и хлоропласта в процессе биосинтеза хлорофиллов 97
1.7.6. Этапы биосинтеза, существенные для механизмов регуляции 106
1.7.7. Механизмы обратного ингибирования синтеза хлорофилла 111
1.7.8. Заключение 114
2. Материалы и методы 118
2.1. Генетический материал 118
2.2. Условия культивирования штаммов хламидомонады 118
2.3. Тестирование признака – парализованные жгутики 118
2.4. Гибридологический анализ мейотического потомства 120
2.5. Определение типа спаривания 122
2.6. Определение размеров клеток 122
2.7. Мутагены и методы мутагенеза 122
2.8. Метод спектрофотометрии 123
2.9. Определение качественного и количественного состава порфиринов 124
2.10. Определение АЛК-синтетазной активности 125
2.11. Определение содержания протогема в клетках С. reinhardtii 126
2.12. Определение активности магний-хелатазы 127
2.13. Выделение и анализ нуклеиновых кислот из С. reinhardtii 128
2.14. Вестерн-блот анализ 129
2.15. Трансформация клеток методом «стеклянных шариков» 130
2.16. Время генерации культур 131
2.17. Получение автолизина 131
2.18. Статистическая обработка данных 131
2.19. Компьютерные программы и базы данных 132
3. Экспериментальные исследования 133
3.1. Генетико-биохимические исследования хлорофильных мутантов
хламидомонады, накапливающих порфирины 133
3.1.1. Первичная характеристика мутантов 134
3.1.1.1. Мутанты хламидомонады, использованные в работе 134
3.1.1.2. Спектрофотометрия мутантов 135
3.1.2. Гибридологический анализ хлорофильных оранжевых мутантов 137
3.1.2.1. Оптимизация условий проведения скрещиваний 137
3.1.2.2. Анализ комплементации мутаций у ХОМ C. reinhardtii 140
3.1.2.3. Изучение рекомбинации мутантных аллелей в группе ХОМ... 145
3.1.2.4. Тетрадный анализ мутантов по генам CHL1 и LTS3 С. reinhardtii 147
3.1.2.5. Использование анеуплоидии для картирования мутаций 149
3.1.3. Биохимические исследования ХОМ C. reinhardtii 155
3.1.3.1. Анализ пигментного состава клеток ХОМ C. reinhardtii 156
3.1.3.2. Активности ферментов биосинтеза хлорофилла у ХОМ C. reinhardtii 160
3.1.3.3. Белковые компоненты фермента магний-хелатазы у мутантов C. reinhardtii по генам CHL1 и LTS3 161
3.1.4. Обсуждение результатов 162
3.1.5. Выводы 173
3.2. Идентификация гена CHLH С. reinhardtii, кодирующего большую субъединицу магний-хелатазы 175
3.2.1. Клонирование гена CHLH. Выбор стратегии и результаты 177
3.2.2. Идентификация мутантный аллелей: chl1 и brs-1 гена CHLH 182
3.2.3. Вестерн-блот анализ белков магний хелатазы С. reinhardtii 185
3.2.4. Геномная комплементация мутантного фенотипа 186
3.2.5. Экспрессия гена CHLH хламидомонады. Регуляция светом 186
3.2.6. Структурно-функциональные характеристики гена CHLH 188
3.2.6.1. Компьютерный анализ гена CH LH 188
3.2.6.2. Сравнительный анализ белка CHLH C. reinhardtii 189
3.2.7. Обсуждение результатов 193
3.2.8. Выводы 198
3.3. Идентификация гена LTS3 зеленой водоросли C.reinhardtii 199
3.3.1. Введение 199
3.3.2. Пигментный состав клеток хламидомонады, мутантных по гену LTS3 201
3.3.3. Активность ферментов биосинтеза хлорофилла 203
3.3.4. Зеленение мутантов: y-7, brc-1 и lts3 204
3.3.5. Экспрессия генов ферментов биосинтез хлорофиллов 205
3.3.6. Картирование гена LTS3 207
3.3.7. Позиционное клонирование гена LTS3 208
3.3.8. Структура гена LTS3 и кодируемого им белка 212
3.3.9. Мутантные аллели гена LTS3 215
3.3.10. Экспрессия гена LTS3 216
3.3.11. Филогения гена LTS3 218
3.3.12. Поиски GATA-мотивов в промоторных областях генов C. reinhardtii, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофиллов 220
3.3.13. Обсуждение результатов 222
3.3.14. Выводы 232
3.4. Супрессия мутаций в гене LTS3 C. reinhardtii 235
3.4. 1. Получение ревертанта Brc-8 и характеристика его фенотипа 236
3.4.2. Гибридологический анализ ревертанта Brc-8 238
3.4.3. Тетрадный анализ мутации sup3 239
3.4.4. Анализ доминантности/рецессивности супрессорного эффекта мутации sup3 241
3.4.5. Получение инсерционного мутанта T8-3 243
3.4.6.Фенотип инсерционного мутанта T8-3 244
3.4.7. Гибридологический анализ штамма Т8-3 245
3.4.8. Поиски гена SUP-1, в геноме трансформанта Т8-3 248
3.4.9. Экспресия гена LTS3 в клетках инсерционного мутанта Т8-3 252
3.4.10. Активность магний-хелатазы в клетках штаммов Brc-8 и Т8-3 253
3.4.11. Обсуждение результатов 254 3.4.14. Выводы 259
3.5. Изучение генетической регуляции биосинтеза хлорофиллов на модели мутантов C. reinhardtii по гену CHLH 260
3.5.1. Получение и описание коричневых мутантов хламидомонады 261
3.5.2. Гибридологический анализ коричневых мутантов хламидомонады 262
3.5.3. Влияние мутации mod-u-25 на синтез АЛК 264
3.5.4. Фенотипический эффект мутации mod-u-25 267
3.5.5. Влияние mod-u-25 на экспрессию генов HSP70A и CabII 269
3.5.6. Обсуждение результатов 272
3.5.7. Выводы 277
Заключение 279
Основные выводы 292
Литература
