Введение
1. Список сокращений 6
2. Введение 8
3. Обзор литературы 10
3.1. Прионы и амилоиды 10
3.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот 10
3.1.2. Прионы и амилоиды низших эукариот 14
3.1.3. Амилоиды прокариот 17
3.2. Краткая история исследований фактора [PSI+] 18
3.3. [PSI+] и терминация трансляции 19
3.4. «Жизненный цикл» [PSI+] 21
3.5. Варианты приона [PSI+] 28
3.6. Структура белка Sup35 31
3.7. Мутации в гене SUP35, влияющие на стабильность фактора [PSI+] 34
3.8. Межвидовой барьер для передачи приона [PSI+] 36
3.9. Модели структурной организации агрегатов Sup35p 38
3.10. Заключение 41
4. Цель и задачи 42
5. Материалы и методы 43
5.1. Плазмиды 43
5.2. Штаммы 45
5.3. Среды и условия культивирования 46
5.4. Генетические методы 47
5.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформация 47
5.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей S. сerevisiae 48
5.4.3. Оценка митотической стабильности приона [PSI+] 48
5.4.4. Оценка передачи и потери приона [PSI+] 49
5.4.5. Подсчет количества пропагонов 49
5.4.6. Оценка эффективности нонсенс-супрессии 49
5.5. Молекулярно-биологические методы 50
5.5.1. Сайт-направленный мутагенез 50
5.5.2. Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делецией гена RNQ1 52
5.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) 53
5.5.4. Неспецифическая окраска белков 54
5.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле (SDD-AGE) 54
5.5.6. Вестерн-блот гибридизация 55
5.5.7. Секвенирование 55
5.6. Очистка белков из культур E. сoli 55
5.7. Просвечивающая электронная микроскопия 56
5.8. Цифровая обработка изображений 57
5.9. Статистическая обработка 57
6. Результаты 58
6.1. Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP35 58
6.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+] 60
6.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют [PSI+] даже в присутствии гена SUP35 дикого типа 60
6.2.2. При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KK оказвают различное влияние на свойства и поддержание приона [PSI+] 63
6.2.3. Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35p 65
6.2.4. Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KK 66
6.2.5. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатов Sup35p 67
6.2.6. Белки Sup35-M1 и Sup35-M2 включаются в состав прионных агрегатов [P SI+] 69
6.2.7. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 могут индуцировать возникновение приона [PSI+] de novo 70
6.2.8. Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит от количества клеточных делений 71
6.2.9. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическую стабильность приона [PSI+] 73
6.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размера агрегатов Sup35p 74
6.2.11. Все мутантные аллели незначительно увеличивают стабильность агрегатов Sup35p при нагревании 75
6.2.12. Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, более «сильного» варианта приона [PSI+] 77
6.2.13. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагонов в клетке 78
6.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+] 80
6.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSI+] при сочетании с другими аллелями sup35KK 80
6.3.2. Дестабилизация [PSI+] в присутствии сочетаний мутаций sup35KK сопровождается увеличением размера агрегатов Sup35p 81
6.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабильность агрегатов Sup35p 82
6.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [PSI+] 83
6.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [PIN+]-статуса клеток 85
6.6. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro 86
7. Обсуждение 92
7.1. Влияние мутаций sup35-M1 и sup35-M2 на стабильность [PSI+] 93
7.2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойства приона [PSI+] 96
7.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+] 100
7.4. Заключение 102
8. Выводы 104
9. Список литературы 105
10. Благодарности 118
