Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1.1 . Иммунность к собственному колицину 10
1 1 2 Защита от колицинов 11
1 1 3 Эволюция колицинов 11
1.1 4 КолицинЕІ 13
1.2. Микроцины 15
1 2 1 МикроцинВ17 18
1.2 2. Механизм действия микроцина В17 21
1 2.3. Иммунитет к микроцину В17 22
1 2 4. Регуляция экспрессии микроциновых генов 22
1.2.5. Устойчивость к микроцину типа В 25
1 2 6. Другие микроцины типа В 26
1 3. Экологическая роль колицинов и микроцинов 27
13.1. Теоретические модели изучения экологии бактериоцинов 30
1 3 2. Экспериментальные модели изучения экологии бактериоцинов 34
1 4 Применение колицинов и микроцинов 35
1 4 1 Пробиотики 36
1 4.2. Пробиотики на основе Е coh 39
Глава 2 Материалы и методы 43
21 Бактериальные штаммы, плазмиды, бактериофаги 43
2 2 Среды и условия культивирования 45
2 3 Установление продукции бактериоцина 46
2 4. Определение типа бактериоцина 47
2 5 Селекция на бактериоцинах 47
2 6 Трансформация клеток Е coh 48
2 7 Трансдукция бактерий 49
2 7 1 Приготовление лизатов 49
2 7 2 Трансдукция с использованием Р1 фаголизатов 49
2 8 Электротрансформация бактерий 50
2 9. Манипуляции с ДНК 50
2 9 1. Выделение плазмидной ДНК 50
2.9 2 Очистка плазмидной ДНК 51
2.9.3. Концентрирование ДНК 52
2.9.4. Электрофорез в агарозном геле 52 2.9 5. Выделение фрагментов ДНК из агарозы 52
2.10. Картирование ДНК 53
2.11. Клонирование 54
2.11.1. Дефосфорилирование ДНК 54
2.11.2. Лигирование 54 2.11 3. Превращение выступающих 5/-концов в тупые 55
2.11.4. Превращение выступающих 3 -концов в тупые 55
2.11 5. Встраивание линкеров 56
2.11.6. Клонирование генов, связанных с продукцией и иммунностью к микроцину 56
2.1161. Приготовление фаголизатов Ми 56
2.11 6 2. Трансдукция с использованием фаголизатов Ми 57
2.11.6 3. Конструирование двойного лизогена 57
2.11.64 Получение банка генов 58
2 12 Полимеразная цепная реакция и подбор праймеров 59
2 13. Секвенирование ДНК 60
2.1.4 Объекты исследования 61
Глава 3 Результаты и обсуждение 63
3.1 Антагонистические свойства штамма Е coh S5/98 63
3.1.1. Генетическое маркирование штамма Е coh S5/98 63
3 1 2. Перекрестная устойчивость штамма Е coh S5 Sm и индикаторных
культур 64
3.1 3 Кривые роста штамма Е coh S5 Sm и индикаторных культур 64
3 1.4 Конкурентная динамика штаммов-продуцентов разных
бактериоцинов 66
3 1 5 Получение штамма-продуцента микроцина и колицина 70
3 2 Исследование генов штамма Е coh S5/98, связанных с продукцией микроцина и иммунностью к нему 72
3 2 1 Клонирование микроциновых генов 73
3 2 2 Структура клонированного фрагмента 76
3 2 3 Субклонирование генов иммунности к микроцину В5 77
З 3 Устойчивость к микроцину типа В 79
3.4 Получение изогенных рекомбинантных штаммов кишечной палочки -продуцентов комплекса антибиотических факторов 82
3.4.1. Конструирование векторов 83
3.4 2. Конструирование илазмид с генами бактериоцинов двух типов 83
3 5 Исследование поведения рекомбинантных штаммов кишечной палочки - продуцентов комплекса антибиотических факторов т vitro 85
3.5.1. Стабильность рекомбинантных плазмид в штамме Е coll М17 85
3 5 2. Перекрестная устойчивость штаммов производных Е coll Ml7 86
3 5.3. Динамика популяций штаммов производных Е coll М17 в смешанных культурах 88
3 6. Моделирование динамики микроциногенной популяции в гомогенной среде 93
3 7 Эксперименты на животных 94
Заключение 98
Выводы 103
Список литературы 104
Приложения 119
