Введение
Часть 1 - Макрофаги 11
Происхождение макрофагов 11
Метаболизм макрофагов 14
Рецепторы макрофагов , 15
Функции макрофагов 19
Концепция дихотомии макрофагальной активации ...24
Часть 2 - Канцерогенез и воспаление 27
Регуляция воспаления 27
Связь онкологических заболеваний с хроническим воспалением 30
Часть 3 - Опухоль ассоциированные макрофаги 31
Опухоль ассоциированные макрофаги - маркер плохого прогноза 33
Цитокины определяют функцию опухоль ассоциированных макрофагов 35
Свойства опухоль ассоциированных макрофагов 38
Материалы и методы 43
Выделение макрофагов из лейкоцитарной пленки 43
Цитокины, факторы роста и другие медиаторы 44
Субтрактивная гибридизация 45
Анализ полученных клонов 47
Норзерн блот гибридизация 47
Пробы для гибридизации 48
Синтез кДНКдля ПЦР и количественной ПЦР 48
Анализ альтернативного сплайсинга фибронектина 49
Количественная полимеразная цепная реакция 49
Анализ дифференциальной экспрессии генов при помощи биочипов фирмы Affymetrix 51
Детекция белка фибронектина 52
Анализ экспрессии белков FXIIIa и TGFpRII 53
Анализ фосфорилирования белка Smad2 53
Анализ фагоцитозной активности макрофагов 54
Анализ секреции цитокинов 54
Анализ бактерицидной активности макрофагов 55
Антитела для иммунофлуоресценции 55
Получение стабильно трансфецированных клеточных линий 56
Анализ эндоцитоза 56
Проточная цитометрия 57
Обработка вортманнином 58
Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия 58
Результаты 61
Маркеры макрофагов второго типа активации , 61
Клонирование человеческого и мышиного стабилина-1 61
Анализ экспрессии стабилина в различных тканях 64
Анализ структуры белка стабилина-1 66
Стабилин-1 отвечает за эндоцитоз acLDL в стабильно трансфецированных клетках СНО 69
Вортманнин вызывает накопление acLDL в ранних эндосомах 75
Вортманнин влияет на локализацию стабилина-1 в человеческих макрофагах 78
Молекулярная гетерогенность популяции макрофагов второго типа 79
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов 80
Анализ экспрессии фибронектина и piG-НЗ в макрофагах 82
Анализ сплайсинга фибронектина 83
Анализ экспрессии белка фибронектина 84
Синтез компонентов внеклеточного матрикса и ферментов для его ремоделлинга стимулируется IL-4 и подавляется дексаметазоном 86
IL-4 запускает, а глгококортикоиды модулируют продукцию цитокинов макрофагами второго типа 90
Глгококортикоиды стимулируют фагоцитоз и экспрессию скавенджер-рецепторов 91
Исследование пластичности макрофагального фенотипа 94
Анализ экспрессии рецепторов к цитокинам на Thl/Th2 поляризованных макрофагах 94
Продукция противовоспалительных цитокинов активируется при вторичной стимуляции ТЬ2-ассоциированными цитокинами и глюкокортикоидами 98
Зрелые макрофаги производят провоспалительные цитокины в ответ на бактериальные продукты, но не ТЫ цитокин IFN-gamma 100
Ответ макрофагов регулируется на уровне мРНК 105
Кинетика продукции цитокинов 106
Анализ фагоцитозной активности макрофагов после вторичной стимуляции 109
Анализ бактерицидной активности макрофагов после вторичной стимуляции 110
Анализ IL17BR - маркера макрофагов второго типа 112
Анализ сплайс-вариантов IL-17BR , 115
Анализ экспрессии белка IL-17BR 117
Активация макрофагов трансформирующим фактором роста бета 120
TGF-pl активирует экспрессию IL-17BR не только в моноцитах, но и в зрелых макроафгах второго типа 122
Анализ дифференциальной экспрессии генов в зрелых макрофагов, стимулированных TGF-pi 123
Подтверждение данных, полученных при помощи биочипов 128
Анализ экспрессии генов «раннего ответа» в M2iu4 стимулированных TGF-pi 129
Дексаметазон регулирует поверхностную экспрессию TGFpRII 130
Дексаметазон приводит к поверхностной экспрессии рецептора KTGF-p 133
Кинетика и дозозависимость действия дексаметазона на поверхностную экспрессию TGFPRII 136
Функциональная активнось TGFpRII 139
Влияние дексаметазона на негативную обратную связь Smad-зависимого сигнального пути 142
Обсуждение результатов 146
Разнообразие макрофагальных фенотипов 147
Модель опухоль ассоциированных макрофагов 149
Сложность системы мононуклеарных фагоцитов 153
Комплексная система внутриклеточной передачи сигнала 155
Процессы везикулярного транспорта в макрофагах 161
Математическое моделирование 170
Математические модели путей передачи сигнала 171
Построение моделей везикулярных процессов 174
Калибровка модели 175
Заключение 175
Выводы 178
Список литературы
