Введение
II. Литературный обзор 9
1. Тирозинкиназы. 9
1.1. Нерецепторные тирозинкиназы. 11
1.2. Рецепторные тирозинкиназы. 12
1.2.1. Структура рецепторных тирозинкиназ. 12
1.2.2. Механизм активации рецепторных тирозинкиназ. 15
1.2.3. Внутриклеточная передача сигнала рецепторных тирозинкиназ. 18
1.2.4. Инсулиновое семейство рецепторных тирозинкиназ. 20
1.2.5. Рецептор, подобный инсулиновому рецептору 21
2. Гетерологическая экспрессия белков. 24
2.1. Системы экспрессии. 24
2.1.1. Прокариотические системы экспрессии. 25
2.1.2. Эукариотические системы экспрессии. 27
2.2. Векторы. 35
3. Выделение и очистка рекомбинантных белков 37
4. Моноклональные антитела. 41
4.1. Получение моноклональных антител 41
4.2. Применение моноклональных антител. 47
III. Экспериментальная часть 49
1. Материалы. 49
1.1. Реактивы 49
1.2. Сорбенты. 49
1.3. Антитела 50
1.4. Клеточные линии. 50
1.5. Растворы 50
1.6. Оборудование. 51
2. Методы. 51
2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами. 51
2.1.1. Создание генетических конструкции для экспрессии. 51
2.1.2. Выделение геномной ДНК из CHO-K1. 52
2.1.3. Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции. 53
2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле. 53
2.1.5. Секвенирование ДНК 53
3. Работа с эукариотическими клетками. 53
3.1. Скрининг клеточной линии CHO-K1. 53
3.2. Культивирование CHO-K1. 54
3.3. Культивирование HEK293. 54
3.4. Трансфекция эукариотических клеток методом липофекции. 54
4. Работа с белками. 55
4.1. Очистка 55
4.1.1. Подготовка культуральной среды к очистке. 55
4.1.2. Анионообменная хроматография на DEAE-650. 55
4.1.3. Гель фильтрация на HW-55F 55
4.1.4. Анионообменная хроматография на Mono Q. 56
4.1.5. Гель-фильтрация на Superose 6. 56
4.1.6. Аффинная хроматография на CNBr сефарозе 4B. 56
4.1.7. Аналитическая гель фильтрация на Superose 6. 57
4.2. Активация IRR-GFP. 57
4.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле. 57
4.4. Вестерн-блот. 58
4.5. Спектрометрическое определение концентрации белка. 58
4.6. Круговой дихроизм. 58
4.7. Оценка гликозилирования. 58
4.8. Масс-спектрометрия MALDI. 59
4.9. Флуоресцентная микроскопия живых клеток. 59
5. Работа с моноклональными антителами. 59
5.1. Получение моноклональных антител 59
5.1.1. Иммунизация мышей. 59
5.1.2. Получение гибридом 60
5.1.3. Выделение моноклональных антител. 60
5.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. 61
5.3. Определение изотипа моноклональных антител. 61
5.4. Иммуноцитохимия. 62
5.5. Активация и ингибирование моноклональными антителами 63
IV. Результаты и обсуждение 64
1. Объект исследования . 64
2. Система экспрессии. 69
3. Культивирование CHO-K1. 72
4. Очистка 73
5. Вестерн-блот. 82
6. Аналитическая гель-фильтрация и гель-электрофорез. 83
7. Масс-спектрометрический анализ выделенного препарата эктодомена IRR. 83
8. Оценка уровня гликозилирования IRR. 84
9. Анализ эктодомена IRR методом кругового дихроизма. 86
10. Получение и очистка моноклональных антител. 87
11. Определение изотипа моноклональных антител. 88
12. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. 89
13. Иммуноцитохимия с моноклональными антителами 90
14. Доменное картирование участков связывания моноклональных антител. 93
15. Оценка влияния моноклональных антител на активацию IRR 94
16. Создание системы гетерологической экспрессии полноразмерного IRR. 95
V. Выводы 99
VI. Благодарности 100
VII. Список литературы 101
