Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика болезни Ауески 11
1.2. Общая характеристика вируса болезни Ауески 12
1.3. Структурно-функциональная характеристика гликопротеинов gB HgDBBA 14
1.3.1. Структурная характеристика гликопротеина gB ВБА 15
1.3.2. Структурная характеристика гликопротеина gD ВБА 20
1.3.3. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в проникновении вируса в клетки 21
1.3.3.1. Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками 21
1.3.3.2. ГС-независимое связывание альфагерпесвирусов с клетками 26
1.3.3.3. Слияние вирусной оболочки и плазматической клеточной мембраной 28
1.3.3.4. Распространение альфагерпесвирусов от клетки к клетке 30
1.4. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в индукции противовирусного иммунитета 32
1.5. Заключение по литературному обзору 35
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1. Химические реактивы, среды и материалы 37
2.2. Животные 37
2.3. Сыворотки и антитела 37
2.4. Культуры клеток и вирусные штаммы 38
2.5. Определение титра инфекционности вируса ВБА 39
2.6. Очистка вируса 40
2.7. Получение вирионов ВБА, меченых [ ^І-метионином 40
2.8. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к белкам ВБА 40
2.9. Наработка и очистка моноклональных антител 41
2.10. Получение конъюгатов антител с пероксидазой хрена 42
2.11. Определение концентрации белка 42
2.12. Электрофорез белков 43
2.13. Иммуноблоттинг 43
2.14. Иммунопреципитация радиоактивно-меченых вирусных белков 43
2.15. Исследование взаимодействия вирусных гликопротеинов с конканавалин А-сефарозой 44
2.16. Очистка гликопротеинов gB и gD с помощью аффинной хроматографии 44
2.17. Иммунопероксидазное окрашивание инфицированных клеток 46
2.18. Получение и контроль реконструированных липосом 47
2.18.1. Получение и реконструированных липосом 47
2.18.2. Получение радиоактивно-меченых реконструированных
липосом 48
2.18.3. Приготовление реконструированных липосом, нагруженных репортерными молекулами 48
2.18.4. Оценка проницаемости мембран липосом по одновалентным катионам (К+) 48
2.18.5. Определение ориентации гликопротеинов ВБА в мембране виросом. 49
2.19. Исследование взаимодействия гликопротеинов gB, gD и виросом
с клетками 49
2.19.1. Исследование связывания гликопротеинов gB, gD и виросом с клетками 49
2.19.2. Специфичность взаимодействия гликопротеинов gB, gD и виросом с клетками 50
2.19.3. Взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА и виросом с гепарансульфатами клеток 51
2.19.4. Влияние обработки клеток гепариназой на связывание gB и виросом с клетками 51
2.19.5. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию вирионов ВБА на клетках 51
2.19.6. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию инфекционных вирусных частиц на клетках 52
2.19.7. Интернализация виросом клетками 52
2.20. Связывание гликопротеина gB ВБА с гепарин-сефарозой. 53
2.21. Иммуноферментные методы 53
2.21.1. Определение ВБА-специфических антител с помощью непрямого ИФА 53
2.21.2. Двуцентровые gB, gD- и gE -специфические «сэндвич» ИФА 54
2.21.3. Определение gB-, gE- и gD-специфических антител с помощью прямых блокирующих ИФА 55
2.21.4. Определение эпитоп-специфических антител в сыворотках 55
2.21.5. Топографическое эпитопное картирование гликопротеина gD ВБА 56
2.21.6. Определение чувствительности эпитопов гликопротеина gD к 56
денатурации
2.22. Влияние gD-специфических антител на развитие вирусной инфекции in vitro 57
2.22.1. Определение вируснейтрализующей активности антител 57
2.22.2. Оценка влияния gB и gD -специфических антител на проникновение вируса внутрь клеток 57
2.22.3. Влияние gD-специфических мкАТ на распространение вируса от клетки к клетке 58
2.23. Исследование иммуногенной активности препаратов очищенных гликопротеинов gD и реконструированных липосом 58
2.24. Пассивная защита животных с помощью gB и gD-специфических мкАТ 59
2.25. Статистическая обработка результатов 59
ГЛАВА 3. Результаты исследований 60
3. Получение gD- и gB-специфических моноклональных антител и разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов 60
3.1. Получение панели gD-специфических мкАТ 60
3.2. Получение gB-специфических мкАТ 63
3.3. Разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов gB
и gD ВБА 63
4. Изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами клеток 70
4.1. Взаимодействие гликопротеина gB с клеточными культурами 70
4.2. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию вируса на клетках 73
4.3. Связывание gB ВБА с иммобилизованным гепарином 75
4.4. Изучение связывания гликопротеина gB с гепарансульфатами клеток 77
4.5. Характеристика гепарансульфат-связывающего центра гликопротеина gB ВБА 79
4.6. Взаимодействие гликопротеина gD с клетками 80
5. Изучение взаимодействия вирусных гликопротеинов ВБА с
клетками с использованием метода реконструированных липосом 82
5.1. Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом 82
5.2. Изучение связывания виросом с клетками 84
5.3. Интернализация виросом клетками 88
6. Изучение антигенной структуры гликопротеина gD ВБА 89
6.1. Топографическое эпитопное картирование gD ВБА 90
6.2. Характеристика эпитопов gD ВБА 92
6.3. Консервативность антигенной структуры гликопротеина gD ВБА 94
7. Изучение гуморального иммунного ответа на гликопротеин gD ВБА 95
7.1. Вклад конформационных и линейных эпитопов гликопротеина gD
в индукцию гуморального иммунного ответа 95
7.2. Эпитоп-специфический гуморальный иммунный ответ на гликопротеин gD ВБА 96
8. Индукция защитного иммунитета гликопротеином gD ВБА 98
8.1. Противовирусная активность gD-специфических антител in vitro 98
8.2. Пассивная иммунизация мышей gD-специфическими мкАТ 101
8.3. Защитная активная иммунизация мышей гликопротеином gD ВБА 102
9. Индукция противовирусного иммунитета при иммунизации мышей
вирусными антигенами, реконструированными в мембраны липосом 104
10. Разработка gD-ИФА для серологической диагностики БА 105
11. Обсуждение результатов 111
11.1. Изучение взаимодействия гликопротеина gB ВБА с клетками 111
11.2. Реконструкция вирусных гликопротеинов в мембраны липосом и изучение взаимодействия протеолипосом с клетками и их имуногенности 117
11.3. Исследование антигенной структуры и роли в индукции противовирусного иммунитета гликопротеина gD ВБА 121
11.4. Разработка ИФА для серологической диагностики БА 129
Заключение 132
Выводы 134
Список основных публикаций по теме диссертации 135
Список литературы 137
