Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
16
1.1. Современные представления о филогении позвоночных
16
1.2. Немодельные объекты в эволюционной биологии развития
19
1.2.1. Миноги – современные представители бесчелюстных, древнейшей эволюционной линии позвоночных
21
1.2.2. Хрящевые рыбы – базальная филогенетическая ветвь челюстноротых
29
1.2.3. Осетрообразные – современные представители одной из древнейших групп челюстноротых
31
1.3. Подходы и методы исследования особенностей экспрессии и функциональных свойств генов у немодельных объектов
34
1.4. Геномные дупликации, как важнейшая предпосылка эволюционного успеха позвоночных
42
1.4.1. Модели полногеномных дупликаций в ранней эволюции позвоночных
49
1.5. Конечный мозг – уникальная инновация позвоночных
52
1.5.1. Гены семейства Noggin позвоночных – ранние эмбриональные индукторы, участвующие в развитии переднего мозга
56
1.5.2. Гены foxg1 – ключевые регуляторы развития переднего мозга позвоночных
59
1.5.3. Ген anf – уникальный ген позвоночных, участвующий в закладке зачатка конечного мозга
60
1.6. Парные конечности – важная составляющая эволюционного успеха позвоночных
62
1.6.1. Предпосылки появления парных плавников: нехордовые вторичноротые и беспозвоночные хордовые
64
1.6.2. Разнообразие и особенности строения парных плавников у позвоночных
68
1.6.3. Появление парных плавников в эволюции позвоночных: палеонтологические данные
74
1.6.4. Особенности развития непарных и парных плавников и поиск переходного состояния
81
1.6.5. Гомология непарных и парных плавников
88
1.6.6. Эпителиально-мезенхимный переход в зачатках парных конечностей
89
1.6.7. Генетические механизмы формирования плавников
91
1.6.8. Теории происхождения парных плавников
94
1.7. Особенности эмбриональной индукции у миног, как современных представителей древнейшей эволюционной ветви позвоночных
99
2
1.8. Внутриклеточные сигнальные каскады
102
1.9. Регенерация у позвоночных
107
2. РЕЗУЛЬТАТЫ
110
2.1. Гены семейства Noggin – регуляторы раннего развития позвоночных
110
2.1.1. Гены семейства Noggin бесчелюстных
110
2.1.1.1. Анализ филогении и геномной синтении генов и белков Noggin миног и челюстноротых
112
2.1.1.2. Исследование динамики экспрессии генов noggin речной миноги
117
2.1.1.3. Исследование пространственной экспрессии генов noggin на ранних стадиях развития речной миноги L. fluviatilis
118
2.1.1.4. Исследование функциональной активности и эволюционного консерватизма свойств генов noggin миног
125
2.1.2. Гены семейства Noggin челюстноротых
128
2.1.2.1. Анализ филогении и геномной синтении генов noggin хрящевых рыб
128
2.1.2.2. Пространственная экспрессия генов noggin2 и noggin4 у серой кошачьей акулы
138
2.1.2.3. мРНК акульего гена noggin2 индуцирует полные дополнительные оси у Xenopus laevis
143
2.1.2.4. Гены семейства Noggin наземных позвоночных на примере амфибий
146
2.1.2.5. Экспрессия генов noggin2 и noggin4 в эмбриональном развитии X. laevis
148
2.1.2.6. Noggin2 индуцирует формирование полных вторичных осей тела у эмбрионов X. laevis
152
2.1.2.7. В нормальном развитии мРНК noggin2 транслируется с большей эффективностью, чем noggin1
157
2.1.2.8. Noggin2 индуцирует нейральную и подавляет мезодермальную дифференцировку в эксплантатах тканей X. laevis
161
2.1.2.9. Белки Noggin обладают способностью подавлять фосфорилирование молекул Smad2 в эмбрионов X. laevis
162
2.1.2.10. Белки Noggin1 и Noggin2, кроме молекул BMP могут связывать лиганды TGF- и Wnt сигнальных каскадов
168
2.1.2.11. Белки Noggin1 и Noggin2 могут ингибировать сигнальные каскады Activin/Nodal и Wnt
170
2.1.2.12. Активность Noggin2 в передней части нервной пластинки важна для развития переднего мозга
174
2.1.2.13. Ингибирование ActivinB белком Noggin2 необходимо для развития переднего мозга
175
2.1.2.14. Noggin4 участвует в развитии головных структур, но не индуцирует формирование дополнительных осей
179
3
2.1.2.15. Исследование роли Noggin4 в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов
182
2.1.2.16. Подтверждение способности белка Noggin4 связывать Wnt8 методом ко-иммунопреципитации белков, выделенных из внеклеточной фракции эмбрионов
191
2.1.2.17. Анализ связывания белка Noggin4 с Wnt8 методом поверхностного плазмонного резонанса
193
2.1.2.18. Noggin4 дополняет свойства трункированного BMP рецептора и в смеси с ним индуцирует полные вторичные оси у эмбрионов шпорцевой лягушки
194
2.1.2.19. Исследование влияния уровня экспрессии гена noggin4 на подвижность клеток в эксплантатах дорсальной маргинальной зоны эмбрионов
195
2.1.2.20. Исследование влияния Noggin4 на активность «неканонического» Wnt/PCP сигнального каскада
197
2.1.2.21. Исследование паттерна экспрессии noggin4 у эмбрионов курицы (Gallus gallus)
199
2.1.3. Исследование роли генов и белков Noggin в регенерации
203
2.1.3.1. Анализ профиля экспрессии генов семейства Noggin в ходе регенерации хвостового отдела эмбрионов речной миноги L. fluviatilis
203
2.1.3.2. Исследование характера и динамики экспрессии генов noggin в регенерации хвоста и конечностей X. laevis методом количественного ПЦР в реальном времени
205
2.1.3.3. Сравнение профилей экспрессии генов noggin с профилями экспрессии генов, вовлеченных в процесс регенерации
207
2.1.3.4. Анализ экспрессии EGFP под контролем промоторов noggin1, noggin2 и noggin4 в ампутированных конечностях трансгенных головастиков шпорцевой лягушки
209
2.1.3.5. Оценка функциональной важности Noggin белков в процессе регенерации
210
2.2. Семейство переднеголовных генов Foxg1 позвоночных
213
2.2.1. Три паралога foxg1 у эволюционно древних групп позвоночных
213
2.2.1.1. Динамика и особенности пространственной экспрессии генов foxg1 у речной миноги (L. fluviatilis)
221
2.2.1.2. Паттерны экспрессии генов foxg1 у стерляди (A. ruthenus)
230
2.2.2. Оценка вероятных сроков дупликации генов foxg1
235
2.2.3. Филогения генов foxg1 осетрообразных соответствует модели предковой геномной дупликации с последующей асинхронной редиплоидизацией
238
2.3. Исследование связи появления генов класса Anf с возникновением конечного мозга
240
2.3.1. Появление гена anf по времени соответствует возникновению конечного мозга
241
2.3.2. Филогенетический анализ белков Anf позвоночных
246
4
2.3.3. Гены anf миног
251
2.3.3.1. Экспериментальная экспрессия кДНК anf миног в эмбрионах X. laevis
251
2.3.3.2. Анализ пространственного паттерна экспрессии lanf и его сопоставление с паттернами экспрессии otx2 и foxg1
256
2.3.3.3. Ген anf миног является транскрипционным репрессором
258
2.3.3.4. Анализ способности мРНК lanf подавлять экспрессию гена otx2 и активировать экспрессию одного из ключевых генов-регуляторов развития переднего мозга - гена foxg1
260
2.3.4. Гетерохрония экспрессии генов anf и foxg1 у миног
263
2.4. Гены семейства Chordin и их роль в появлении парных конечностей позвоночных
269
2.4.1. Гены семейства Сhordin позвоночных
269
2.4.2. Chordin-like1 – новый ген челюстноротых
274
2.4.2.1. Исследование экспрессии гена chordin-like1 у серой кошачьей акулы
275
2.4.2.2. Исследование экспрессии chordin-like1 у стерляди
279
2.4.2.3. Анализ экспрессии chordin-like1 у шпорцевой лягушки
280
2.4.2.4. Исследование функциональных свойств генов chordin-like позвоночных
282
2.4.3. Chordin-like2 – древний ген билатерий
285
2.4.3.1. Анализ динамики и паттерна экспрессии гена chordin-like2 у речной миноги
285
2.5. Особенности эмбриональной индукции у миног
287
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
297
3.1. Семейство генов Noggin позвоночных
297
3.1.1. Консерватизм паттернов экспрессии генов noggin у речной миноги и шпорцевой лягушки
297
3.1.2. Утрата noggin1 у хрящевых рыб - уникальная ситуация для позвоночных
300
3.1.3. Гены noggin2 и noggin4 хрящевых рыб консервативны по характеру экспрессии и функциональным свойствам
302
3.1.4. Утрата noggin1 может быть связана с особенностями строения хрящевого скелета Пластиножаберных
303
3.1.5. Белки Noggin1 и Noggin2 - ингибиторы Nodal/Activin и Wnt сигнальных каскадов
307
3.1.6. Noggin4 модулирует активность Wnt сигнальных каскадов и участвует в регенерации
308
3.1.7. Предполагаемый сценарии появления и эволюции генов семейства Noggin позвоночных
310
3.2. Семейство генов Foxg1 позвоночных
312
3.2.1. Гены foxg1 у миног
312
3.2.2. Гены foxg1 у челюстноротых
313
5
3.2.3. Филогения паралогов foxg1 осетрообразных подтверждают модель предковой геномной дупликации с последующей асинхронной редиплоидизацией
319
3.3. Гены класса Anf у миног
320
3.3.1. Обнаружение гена anf у миног подтверждает гипотезу о роли появления anf в возникновении конечного мозга у позвоночных
320
3.3.2. Гипотеза гибридного происхождения уникальных генов класса Anf позвоночных
321
3.4. Появление гена chordin-like1 могло стать важным фактором возникновения парных плавников и челюстного аппарата челюстноротых
323
3.5. Молекулярный механизм ранней осевой дифференцировки у миног может отличаться от амфибий
326
4. ВЫВОДЫ
331
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
333
5.1. Материалы
333
5.1.1. Реактивы
333
5.1.2. Ферментные препараты
334
5.1.3. Лабораторное оборудование
334
5.1.4. Лабораторные животные
335
5.1.5. Буферы, растворы и микробиологические среды
338
5.2. Методы
339
5.2.1. Биоинформатический анализ филогении и локальной геномной синтении исследуемых генов
339
5.2.2. Получение полноразмерных кДНК исследуемых генов методом обратной транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР)
340
5.2.3. Оценка динамики экспрессии исследуемых генов методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени
343
5.2.4. Синтетические мРНК и морфолиновые олигонуклеотиды
344
5.2.5. Гибридизация in situ
347
5.2.6. Люциферазные тесты
348
5.2.7. Ко-иммунопреципитация и иммуноблоттинг
350
5.2.8. Поверхностный плазмонный резонанс
353
6. БЛАГОДАРНОСТИ
354
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
355
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
357
