Введение
2. Результаты 31
2.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации и ее анализ 31
2.1.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации 31
2.1.2. Анализ полученных последовательностей 32
2.1.3. Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем RT ПЦР 37
2.1.4. Примеры генов с известными гомологами 39
2.2. HyEED-1 - консервативный регуляторныи ген, участвующий в эмбриогенезе 43
2.2.1. Клонирование HyEED-1 43
2.2.2. Анализ экспрессии HyEED 49
2.3 НуЕМВ-1 - ген без известных гомологов, задействованный в эмбриогенезе 54
2.3.1. Клонирование и анализ НуЕМВ-1 54
2.3.2. Анализ экспрессии НуЕМВ-1 методом гибридизации in situ 58
3. Обсуждение 63
3.1. Эмбриональное развитие: что происходит на молекулярном уровне 63
3.2. Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации 66
3.3. Проверка качества библиотеки: необходимо ли это? 68
3.4. Анализ последовательностей кластеров и синглетов библиотеки Kiel 3 70
3.4.1. Общая информация 70
3.4.2. Не имеющие гомологов гены в библиотеке Kiel 3 71
3.5. НуЕМВ-1 - не имеющий гомологов, неизвестный ранее ген 73
3.6. Ген Hydra Embryonic Ectoderm Development эпигенетика и происхождение интерстициальных клеток 75
3.6.1. Функции белков группы Polycomb 75
3.6.2. Hydra EED - самый ранний генетический маркер интерстициальных клеток 77
3.7. Заключительные соображения 80
4. Резюме 83
5. Материалы 85
5.1. Используемые животные 85
5.2. Среды 85
5.3. Растворы 86
5.3.1. Растворы общего назначения 86
5.3.2. Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL 88
5.4. Наборы реагентов 90
5.5. Ферменты (не из наборов реагентов) 90
5.6. Химические реагенты 91
5.7. Радиоактивные нуклеотиды 93
5.8. Векторы 93
5.9. Антитела 93
5.10. Праймеры и олигонуклеотиды 94
5.11. Приборы 37
5.12. Прочие материалы 99
5.13. Компьютерные программы 99
6. Методы 102
6.1. Животные и условия культивирования 102
6.2. Выделение геномной ДНК 103
6.3. Выделение тотальной и матричной РНК 104
6.4. Синтез кДНК путем обратной транскрипции 104
6.5. Лигирование сплинкеретт 105
6.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 106
6.6.1. Амплификация фрагментов ДНК 107
6.6.2. RT ПЦР 107
6.6.3. 3 RACE ПЦР 108
6.6.4. 5 RACE ПЦР 109
6.6.5. ПЦР с вырожденным праймером 110
6.7. Гибридизация по Саузерну 110
6.8. Гибридизация по Ноэерну 112
6.9. Клонирование и сєквенирование 113
6.9.1. АТ-лигирование продуктов ПЦР 113
6.9.2. Компетентные клетки 114
6.9.3. Электропорация и проверка на наличие вставки 115
6.9.4. Выделение плазмид 115
6.9.5. Сєквенирование с использованием системы Li-COR 115
6.9.6. Сєквенирование с использованием системы MEGABACE 500 116
6.10. Подавляющая вычитательная гибридизация 117
6.11. Выращивание библиотеки в бактериях и приготовление макроэррэев 119
6.11.1. Выращивание библиотеки в бактериях, репликация и хранение клонов 119
6.11.2. Упорядоченное нанесение клонов библиотеки на
нейлоновую мембрану и обработка фильтров 120
6.11.3. Гибридизация макроэррэев 121
6.12. Гибридизация in situ 121
6.12.1. Приготовление меченных дигоксигенином проб 121
6.12.2. Гибридизация in situ на целых зародышах 122
6.12.3. Гибридизация in situ на целых полипах 123
6.12.4. Гибридизация in situ на замороженных срезах эмбрионов 124
6.13. Окрашивание антителами 125
6.13.1. Окрашивание антителами взрослых полипов 125
6.13.2. Окрашивание антителами замороженных срезов 126
6.14. Окраска по методу TUNEL 126
Литература 128
Благодарности 141
Официальное заявление 142
